铁（Fe）调控结合减氮施肥：一种通过重塑土壤微生物群落降低亚热带稻田甲烷（CH4）排放的绿色生产策略

《Microbiology Spectrum》：Iron amendment decreases methane emissions from subtropical paddies by altering soil microbial communities

本研究通过为期四年的田间试验，揭示了在减少氮（N）肥用量的同时添加铁（Fe）粉，能有效降低亚热带稻田甲烷（CH4）排放。其核心机制在于，Fe添加通过降低产甲烷菌与甲烷氧化菌的基因丰度比（mcrA/pmoA），改变两者群落构建过程及共现网络，从而抑制CH4生成。研究发现土壤Fe2+含量和产甲烷菌群落结构是驱动CH4排放的关键因素。该成果为实现稻田“减肥”减排提供了微生物学依据和新思路。

　　

引言：稻田甲烷排放与调控挑战

甲烷（CH₄）是仅次于二氧化碳的重要温室气体，淹水稻田是其主要来源之一。过量施用氮（N）肥会加剧CH₄排放，带来一系列环境问题。因此，减少合成氮肥使用已成为中国“化肥使用量零增长行动”的国家战略目标。然而，长期减氮可能影响水稻产量。铁（Fe）作为土壤中重要的电子受体，可参与氧化还原反应，抑制产甲烷菌活性。但关于减氮背景下Fe添加对稻田CH₄排放、产甲烷菌和甲烷氧化菌的影响，目前认知仍很有限。本研究通过四年原位田间试验，旨在阐明：（1）减氮与Fe添加对CH₄排放的影响；（2）土壤中产甲烷菌与甲烷氧化菌的响应；（3）驱动CH₄排放的关键微生物类群与土壤理化因子。

材料与方法

试验在中国江苏省南京市六合区（32°21′N, 118°51′E）进行，该地为稻麦轮作区，属亚热带季风气候。试验为期四年（2020–2023），设置了七个处理：常规氮肥用量（315 kg N hm^-2）的100%、80%、60%和0%（100%N, 80%N, 60%N, 0%N），以及80%、60%和0%氮肥用量结合Fe粉（零价铁，纯度≥99%）添加的处理（80%N+Fe, 60%N+Fe, 0%N+Fe）。Fe粉于2019年水淹前以5000 kg hm^-2施入土壤表面并氧化。每个处理设四次重复。

使用密闭箱法测定各田块的CH₄通量，在水稻生长季定期采样，并通过气相色谱仪分析CH₄浓度，计算通量与累积排放量。在水稻关键生育期（如分蘖期、拔节期）采集耕层土壤（0–20 cm），测定pH、电导率（EC）、总氮（TN）、铵态氮（NH₄⁺–N）、亚铁（Fe²⁺）等理化性质。利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测16S rDNA、产甲烷菌标记基因mcrA和甲烷氧化菌标记基因pmoA的拷贝数。对2022–2023年水稻季的土壤DNA样品进行mcrA和pmoA基因的高通量测序，分析微生物群落组成、多样性、构建过程及共现网络。使用中性群落模型评估群落构建中的随机过程重要性，并通过随机森林模型等统计方法分析影响CH₄排放的关键驱动因子。

结果

CH₄排放动态

在早期淹水期，尤其是分蘖期，观察到CH₄脉冲排放峰。Fe添加显著影响了2020、2022和2023年水稻季峰值期的平均CH₄通量。例如，2020年，60%N+Fe和80%N+Fe处理比相应未加Fe处理的平均CH₄通量分别降低了55.21%和66.20%。在2023年水稻季，60%N+Fe处理比其对应的60%N处理的累积CH₄排放量降低了43.79%，比100%N处理降低了57.33%。方差分析表明，Fe添加而非氮肥减量，是影响累积CH₄排放的关键因素。

微生物基因丰度与比例

Fe添加对mcrA和pmoA基因的绝对或相对丰度在多数时期无显著统计学影响。然而，Fe添加显著降低了整个2023年水稻季的mcrA/pmoA比值，从未加Fe处理的3.31降至加Fe处理的1.62。这表明Fe添加改变了产甲烷菌与甲烷氧化菌之间的平衡，有利于抑制CH₄净排放。

产甲烷菌与甲烷氧化菌群落特征

在门水平上，产甲烷菌群落主要由Methanobacteriota（93.57%–99.52%）组成。在属水平上，主要类群包括Methanobacterium、Methanothrix等。甲烷氧化菌群落则主要由Pseudomonadota（90.17%–92.44%）组成，主要属包括Methylocystis、Methylosinus等。2023年水稻季的核心操作分类单元（ASV）数量多于2022年。群落组装分析显示，在60%常规氮肥水平下，Fe添加增强了产甲烷菌群落构建的随机过程，但降低了其扩散；对甲烷氧化菌群落的影响则呈现相反趋势。在80%常规氮肥水平下，Fe添加增强了甲烷氧化菌群落的随机性。

差异物种、专家种与共现网络

在产甲烷菌群落中鉴定出16个差异丰度ASV，其中15个在Fe添加下上调，1个下调。共发现10个专家种（特异性与占有率均≥0.7），其中60%N+Fe处理的专家种数量最多（n=5）。甲烷氧化菌群落中鉴定出16个差异ASV，并发现2个专家种。共现网络分析表明，无论是产甲烷菌还是甲烷氧化菌群落，Fe添加都导致网络具有更多的边、更高的平均度和更低的模块化程度，意味着微生物间的连接性增强，模块化结构减弱。有趣的是，仅在未加Fe的处理中，特定模块（如产甲烷菌的模块5）的相对丰度与累积CH₄排放呈显著正相关，而甲烷氧化菌的模块2与之呈负相关，这表明Fe添加可能削弱了模块在调控CH₄排放中的作用。

驱动CH₄排放的关键因素

Mantel相关分析表明，影响产甲烷菌丰度的关键环境因子主要是总氮（TN）和Fe²⁺含量。影响甲烷氧化菌群落多样性的关键因子是Fe²⁺含量，而影响其群落结构的关键因子是NH₄⁺–N含量。随机森林模型进一步指出，mcrAPCoA2（表征产甲烷菌群落结构）、氧化还原电位（Eh）、pH、16S rDNA丰度、碳氮比（C/N）和mcrA/16S rDNA比值是影响CH₄通量的重要预测因子。而土壤Fe²⁺含量、mcrA基因丰度和NH₄⁺–N含量是影响累积CH₄排放的关键驱动因子。回归分析证实，mcrAPCoA2和Fe²⁺含量分别与CH₄通量和累积排放量呈显著负相关。

讨论

减氮与Fe添加对CH₄排放及微生物的影响

本研究发现，Fe添加而非单纯减氮，是显著降低CH₄排放的主因。这凸显了氮管理与产甲烷过程相互作用的复杂性，以及Fe在抑制亚热带稻田CH₄排放中的重要作用。以往研究表明，单一Fe氧化物施用可在一定程度上减少稻田CH₄排放，本研究进一步证实，在长期减氮条件下，Fe粉添加能显著降低排放。结合减氮与Fe添加不仅能减少CH₄排放，还能增强生物固氮、维持水稻产量，为水稻绿色低碳生产提供了新方案。

Fe添加降低了mcrA/pmoA比值。在厌氧条件下，Fe³⁺还原过程会与产甲烷过程竞争电子，从而抑制产甲烷菌生长。同时，高浓度Fe²⁺会抑制Fe³⁺还原，减少铁结合有机碳释放的可溶性有机碳（DOC），进一步限制产甲烷菌底物供应。此外，Fe添加改变了产甲烷菌和甲烷氧化菌群落的构建机制。在60%氮肥水平下，Fe添加增强了产甲烷菌群落的随机过程，但削弱了确定性过程对甲烷氧化菌的影响，这反映了微生物对不同施肥模式的复杂响应。

驱动排放的关键类群与土壤因子

土壤Fe²⁺含量是驱动累积CH₄排放的关键环境因子。本研究还发现，当土壤Fe²⁺含量高时，甲烷氧化菌群落多样性也增加，这可能间接影响了CH₄排放。

关键微生物类群可能通过调节代谢途径直接影响CH₄通量。例如，在Fe添加与未添加处理间差异显著的ASV2385、ASV2330和ASV2856均属于Methanobacteriota门，其中ASV2330属于Methanobacterium属。铁是Methanobacterium生长的关键限制因子，直接影响CH₄产生。此外，专家种ASV273（60%N处理中最关键的类群）的相对丰度与累积CH₄排放密切相关，这可能是60%N处理比60%N+Fe处理排放更高的一个重要原因。

Fe添加增强了产甲烷菌和甲烷氧化菌共现网络的连通性，降低了模块化程度。随着确定性过程减弱，种间竞争可能减弱，导致微生物间共现关系增加，网络连接性增强。值得注意的是，仅在未加Fe处理中，特定网络模块与CH₄排放显著相关，而Fe添加削弱了模块的作用，这可能意味着个体物种在网络中的功能得到增强。本研究明确了产甲烷菌群落结构在调控CH₄通量中的重要性，mcrA基因丰度也与累积排放量密切相关。

结论

为期四年的田间研究表明，Fe添加结合减氮施肥（尤其是减少40%氮肥用量的60%N+Fe处理）能显著降低亚热带稻田CH₄排放（降幅约57%），同时维持水稻产量。其减排机制主要在于：Fe添加显著降低了产甲烷菌与甲烷氧化菌的基因丰度比（mcrA/pmoA）；改变了两种功能微生物群落的构建过程（如在60%氮肥下增强产甲烷菌群落的随机性）；并增加了其共现网络的连通性，降低了模块化。土壤Fe²⁺含量和产甲烷菌群落结构是驱动CH₄排放的关键因素。综上所述，减少合成氮肥施用并结合Fe添加，为缓解亚热带稻田CH₄排放提供了一种新途径，有助于推动气候智能型农业发展。