引言
黑叶猴（Trachypithecus francoisi）是中国国家优先保护的野生动物，属于灵长目、猴科、乌叶猴属。其主要分布于中国贵州、广西、重庆以及越南和老挝的破碎化喀斯特山地森林或河谷地带。2015年，该物种在世界自然保护联盟（IUCN）红色名录中被评估为濒危（EN），全球野生种群估计仅有2000-2100只，其中约70%生活在贵州省。然而，快速的全球工业化、城市化以及人为栖息地破坏，导致黑叶猴的分布范围持续缩小和碎片化，形成了多个异质性的孤立种群。在贵州省，原有的5个历史分布点已经消失，目前仅存麻阳河、大沙河、宽阔水、白箐和野钟5个偏远的自然保护区。因此，迫切需要对不同地理种群进行深入研究，以制定有效的保护管理策略。
觅食是动物生存的基础活动，是为其生长、繁殖和活动提供营养与能量的主要来源。物种、群体和个体间的觅食行为差异反映了它们适应局部环境的多样化策略。研究表明，黑叶猴具有广泛的食性范围（至少取食259种植物），并且对叶片有明显的偏好。然而，传统的行为学观察方法在系统追踪高度警觉的动物时面临挑战，导致饮食记录可能不完整。高通量测序技术在动物食性研究中的应用，提升了研究的细节和广度，有助于更全面地调查野生动物的饮食。
新兴研究表明，肠道微生物群对宿主的疾病易感性、营养状态、免疫功能和成熟度具有重要影响。相反，环境和饮食习惯是决定肠道菌群组成的关键因素。大量研究证实，由栖息地变化引起的饮食摄入和环境的改变，会对肠道微生物群产生显著影响。此外，宿主的饮食模式深刻地塑造了肠道微生物的多样性，主要通过提供特定营养物质来促进微生物生长。食物摄入会导致肠道菌群、代谢物和短链脂肪酸发生变化，影响宿主的新陈代谢过程。在相同物种的不同地理种群宿主间，存在相当大的异质性。现有研究主要集中于圈养种群，对于不同地理种群野生黑叶猴肠道微生物群的研究尚存空白。
本研究旨在探讨环境和饮食因素对黑叶猴肠道微生物群落的影响。研究选择了两个不同的野生黑叶猴种群（贵州麻阳河国家级自然保护区和贵州大沙河国家级自然保护区），主要目标为：（1）评估不同环境下黑叶猴饮食组成的潜在差异；（2）检查不同饮食条件下肠道菌群组成和结构的差异；（3）探索饮食模式与肠道菌群之间的关系。通过利用元条形码和16S测序技术，本研究全面阐明了黑叶猴的食性特征和肠道微生物群概况，为该物种的保护和管理提供了基础数据。
材料与方法
研究区域与样本采集
本研究在中国贵州省的两个国家级自然保护区进行：麻阳河国家级自然保护区和大沙河国家级自然保护区。
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大沙河保护区位于遵义市，总面积26,990 hm2，核心区面积9,104.0 hm2，主要保护森林生态系统及银杉、黑叶猴等濒危物种。
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麻阳河保护区位于铜仁市与遵义市交界处，总面积31,113 hm2，核心区面积10,543 hm2，主要保护黑叶猴及其栖息地。
研究于2022年3月，从上述两个保护区共四个黑叶猴种群的夜宿地采集了27份新鲜粪便样本（<24小时）。所有样本采集后立即置于干冰上运回实验室，并储存于-80°C冰箱用于后续分析。采样季节相同以确保植物物候同步。
在粪便采集点附近，设立了10米×10米的植被样方，记录乔木层、灌木、草本和层间植被的物种名称和丰度，并计算了物种丰富度指数（R）、香农-维纳多样性指数（H）和皮卢均匀度指数（E）来表征群落的Alpha多样性。使用索伦森相似性指数（CS）表示两个区域和猴群之间的差异。样方结果显示，麻阳河区域的Alpha多样性指数始终高于大沙河区域，且不同区域之间以及同一区域不同猴群样方之间的相似性指数都相对较低。
DNA提取与PCR扩增
使用OMEGA Soil DNA Kit提取总基因组DNA。使用NanoDrop NC2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别评估DNA的浓度和质量。
使用特异性引物对细菌16S rRNA基因的V3–V4区（引物338F和806R）和叶绿体rbcL基因（引物Z1aF和hp2R）进行PCR扩增。扩增产物纯化、定量后等量混合，在上海派森诺生物科技股份有限公司使用Illumina NovaSeq平台进行双端250 bp测序。
序列分析与生物信息学统计
使用QIIME2 2019.4进行微生物组生物信息学分析。原始序列经过去复用、引物切除、质量过滤、去噪、合并和去除嵌合体等步骤。获得的DNA序列与NCBI和BOLDsystems在线数据库进行比对，以确保序列来自黑叶猴的食物来源。
使用相对读取丰度（RRA）来估算黑叶猴的饮食和微生物组成。使用R软件生成Rank Abundance曲线以评估测序数据的合理性和充分性。使用Mothur v1.30计算Alpha多样性指数，并通过箱线图展示。使用R包“VennDiagram”绘制维恩图，可视化样本或组间共享和特有的OTUs。使用Kruskal-Wallis检验分析组间Alpha多样性差异。基于Bray-Curtis距离评估Beta多样性，并通过非度量多维尺度分析（NMDS）图展示结果。使用基于Bray-Curtis距离的置换多元方差分析（PERMANOVA）检验组间差异的显著性。使用LEfSe（线性判别分析效应大小）分析来进一步调查麻阳河和大沙河之间食性/微生物组成的差异。使用随机森林分类器评估属水平对不同区域和猴群的预测能力。使用R中的cor()函数计算Spearman相关性。使用igraph包进行网络分析，并使用ggplot2进行可视化。通过PICRUSt2分析KEGG代谢通路的差异，以检测麻阳河和大沙河之间功能微生物基因代谢通路的差异。
结果
黑叶猴的食性分析
食性多样性分析
通过对27份黑叶猴粪便内容样本的叶绿体rbcL基因扩增子测序，共获得6,431,715条原始序列和5,738,654条有效序列。总体鉴定出1,969个OTUs。维恩图分析显示，麻阳河和大沙河区域共享627个OTUs，四个猴群共享290个OTUs。
不同区域间食性组成的Alpha多样性分析显示，麻阳河和大沙河在Chao1、Goods coverage、Shannon、Simpson和Observed species指数上均存在显著差异。主坐标分析（PCoA）结果表明，麻阳河和大沙河黑叶猴的食性组成存在显著差异。基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA分析也证实了这一点。
同一地理区域内不同猴群之间的食性Alpha多样性分析则未显示出显著差异，但来自不同区域的猴群之间在Goods coverage和Simpson指数上存在显著变化。Beta多样性分析显示四个猴群之间存在显著差异。PERMANOVA检测发现同一区域内的猴群之间没有显著的食性差异，而区域间的比较则显示出明显的组成差异。
不同区域和猴群的黑叶猴食性组成
在麻阳河和大沙河黑叶猴的食性组成中，共鉴定出134个科，其中相对丰度超过1%的共同科有10个。在麻阳河，黑叶猴的食性以毛茛科（13.52% ± 10.76%）、芸香科（11.64% ± 6.88%）、桦木科（11.49% ± 9.78%）和蔷薇科（9.34% ± 6.67%）为主。而在大沙河，则以漆树科（13.39% ± 11.09%）、芸香科（10.51% ± 8.54%）、樟科（10.47% ± 10.31%）、防己科（10.42% ± 13.57%）和柿树科（10.19% ± 15.79%）为主。Wilcoxon秩和检验显示，在科水平上，漆树科和樟科的相对丰度在大沙河显著高于麻阳河；而蔷薇科、毛茛科、夹竹桃科、卫矛科和报春花科等五个科的相对丰度在麻阳河显著高于大沙河。
在属水平上，共鉴定出336个属。麻阳河的优势类群为铁线莲属（Clematis， 12.14% ± 12.60%）、李属（Prunus， 11.52% ± 20.15%）、桦木属（Betula， 10.60% ± 11.11%）、柑橘属（Citrus， 9.14% ± 8.44%）和柿属（Diospyros， 7.80% ± 17.13%）。大沙河的优势类群则为楠木属（Nectandra， 11.20% ± 9.31%）、花椒属（Zanthoxylum， 8.64% ± 6.12%）、桦木属（Betula， 7.33% ± 14.20%）、木防己属（Cocculus， 6.75% ± 10.83%）和柿属（Diospyros， 6.70% ± 12.49%）。楠木属、花椒属和木防己属在大沙河的丰度显著高于麻阳河；而翅果藤属（Decalepis）、铁线莲属、柑橘属和铁仔属（Myrsine）在麻阳河的丰度则显著更高。
不同区域黑叶猴的食性差异
LEfSe分析结果显示，麻阳河和大沙河之间共有37个具有统计学差异的生物标志物。这些显著差异的生物标志物主要分布在蔷薇目、无患子目和杜鹃花目中。随机森林分析结果显示，在区分麻阳河和大沙河差异的类群中，贡献最大的是科水平的榆科和属水平的刺榆属（Hemiptelea）。
黑叶猴的肠道微生物群
微生物多样性
通过对62份黑叶猴粪便微生物样本进行16S测序分析，共获得67,313,742条原始序列和5,966,530条有效序列。总体鉴定出51,568个OTUs。维恩分析显示，麻阳河和大沙河共享1,987个OTUs。
Alpha多样性分析显示，麻阳河和大沙河在Chao1、Simpson和Pielou_e指数上存在极显著差异。NMDS分析结果也表明，麻阳河和大沙河黑叶猴的微生物组成存在显著差异。PERMANOVA分析同样证实了两个区域间的显著差异。
不同区域黑叶猴的粪便微生物组成
在麻阳河和大沙河黑叶猴的微生物组成中，共鉴定出22个门。厚壁菌门、放线菌门和变形菌门是麻阳河和大沙河黑叶猴肠道微生物的主要组成部分。在属水平上，不动杆菌属、节杆菌属和棒状杆菌属是麻阳河的优势菌属。而大沙河的优势类群则为丛毛单胞菌属、Desemzia属和红球菌属。两个区域共有七个共同的优势菌属。
Wilcoxon秩和检验显示，在门水平上，放线菌门和螺旋体门在麻阳河的相对丰度显著高于大沙河。在属水平上，不动杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、谷氨酸杆菌属（Glutamicibacter）、Jeotgalicoccus属、柠檬球菌属（Citricoccus）和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）在麻阳河的相对丰度均显著高于大沙河。
不同区域黑叶猴粪便微生物组成的差异
LEfSe分析结果显示，麻阳河和大沙河之间共有28个具有统计学差异的生物标志物。最显著的差异生物标志物主要分布在厚壁菌门和变形菌门。在四个猴群中，最显著的差异生物标志物主要分布在变形菌门和厚壁菌门。随机森林分类器分析发现，谷氨酸杆菌属和Facklamia属是麻阳河特异的显著指示菌属；假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）和贪噬菌属（Variovorax）在大沙河具有更高的相对重要性。
PICRUSt功能预测
共分析了34条KEGG代谢通路。结果显示，涉及代谢的通路丰度最高。氨基酸生物合成、碳水化合物代谢以及辅因子和维生素代谢是麻阳河和大沙河丰度最高的五个代谢通路。同时，有26条代谢通路存在显著差异。花生四烯酸代谢途径和玉米素生物合成途径的丰度在麻阳河和大沙河之间存在高度显著差异。
不同野生种群黑叶猴肠道微生物群与食性组成的相关性
对具有显著差异的食性组成和微生物进行了Spearman相关分析，以探究食性与微生物之间的关系。在整体网络图中，食物成分的优势属与厚壁菌门和变形菌门的细菌关系最为密切，表现出不同的正负相关性。大多数食物成分与几乎所有肠道细菌都呈显著正相关，而黄杞属（Engelhardia）、根瘤菌属（Rhizobium）和菝葜属（Smilax）则与肠道细菌呈显著负相关。总之，大沙河和麻阳河黑叶猴的肠道菌群组成存在显著差异，食性组成和结构也是如此。食物组成的变化在一定程度上改变了肠道菌群的结构。
讨论
本研究首次利用元条形码和粪便16S测序技术，探讨了不同野生种群黑叶猴肠道菌群和饮食习惯的结构与功能差异，以及饮食与肠道菌群之间的关系。我们的研究结果强调了饮食模式和环境在塑造肠道微生物多样性和组成方面的关键作用，揭示了栖息在中国贵州省不同喀斯特生态系统中的种群在饮食和微生物群方面存在的显著差异。
黑叶猴的食性组成与结构及其与其他灵长类的比较
我们的研究在贵州喀斯特地区的黑叶猴食性中鉴定出134科336属植物，这一多样性远高于先前报道。这种差异可能与食性分析方法有关。本研究中采用的基于粪便的元条形码技术，能够识别出传统追踪观察难以发现的许多植物。虽然DNA条形码分析比直接观察提供了更全面的研究方法，但它也存在一些缺点，例如只能识别物种，而不能确定食物的确切部位。
蔷薇科、毛茛科、桦木科、芸香科、漆树科和樟科是黑叶猴食物的主要组成部分。白头叶猴、川金丝猴、黔金丝猴和藏酋猴等灵长类动物也对这些科表现出不同程度的偏好。李属、桦木属、柑橘属、柿属、卫矛属、海桐花属、乌檀属、素馨属、花椒属和木防己属是麻阳河和大沙河共同的优势属。李属、柑橘属和柿属的植物因其鲜嫩多汁、风味好且富含维生素C而受到野生动物的青睐。
同一地理区域内不同黑叶猴群体间食性组成和多样性无显著差异，表明该物种在其特定栖息地内维持着稳定的摄食适应策略。不同群体间食物资源选择的高度一致性反映了一种由长期进化过程塑造的保守觅食策略。
在麻阳河地区，黑叶猴饮食中包含柑橘等栽培植物的比例明显高于大沙河地区。这种差异可能归因于麻阳河部分区域存在补充投喂的实践。LEfSe分析显示，榆科是导致麻阳河与大沙河区域差异的重要贡献者。先前的研究证实，榆科植物是麻阳河地区黑叶猴的主要食物组成部分，而其他保护区的黑叶猴则较少取食这些植物。这种差异很可能是不同栖息地植被组成差异的结果。尽管黑叶猴特化适应喀斯特生境，但不同地理种群间的喀斯特地貌和关联植被结构存在相当大的变异。本研究发现，不同地理种群间的栖息地相似性高于同一区域内的不同猴群，而区域间的食性组成差异则大于同一区域内的不同猴群。这表明黑叶猴食性组成的变异可能并非由栖息地差异驱动。尽管同一区域内不同栖息地的植物组成存在显著差异，但该区域内不同猴群的食性组成并未表现出显著不同。这一现象可能归因于黑叶猴对特定植物科或属的偏好，也可能源于植被样方调查未能完全覆盖其觅食区域。不同地理种群间显著的食性差异，突显了黑叶猴在适应多样化栖息地时的行为可塑性。
黑叶猴的肠道微生物及其与其他灵长类的比较
我们的研究确定厚壁菌门、放线菌门和变形菌门是黑叶猴肠道的优势菌门。这与先前孙等人关于麻阳河种群以厚壁菌门和拟杆菌门为主的研究结果，以及广西种群以厚壁菌门（75.38% ± 6.61%）为主的报道有所不同。这种差异可能与测序方法、样本量以及地理差异有关。
黑叶猴的肠道微生物以厚壁菌门比例高为特征，这与大多数灵长类动物相似。黑叶猴大量取食富含木质素和纤维素的叶片，这些成分难以消化。厚壁菌门不仅能将膳食纤维降解为丁酸等小分子以供宿主吸收，还能调节T细胞以提高宿主免疫力、预防肠道炎症并维持肠道微生物生态平衡。
放线菌门在我们的研究中是黑叶猴肠道的第二大菌门，并且在麻阳河和大沙河之间存在显著差异。而在白头叶猴和恒河猴等其他灵长类动物中，其比例仅占一小部分。放线菌门显著介导难分解有机化合物（特别是纤维素和几丁质）的分解，驱动有机质周转和全球碳循环的生物地球化学过程，同时也是腐殖化过程中的重要媒介。这些功能差异可能归因于不同系统发育谱系对栖息地的特异性适应。
氨基酸生物合成、碳水化合物代谢以及辅因子和维生素代谢是黑叶猴的主要代谢通路。在发育和应激反应期间，氨基酸生物合成尤为重要，尤其是在营养胁迫条件下。此外，环境和营养物质常影响脂肪酸生物合成和脂质积累。食叶灵长类通常拥有较长的消化道，这增加了食物滞留时间，促进了纤维和次生代谢物的分解，其肠道微生物群往往富集与氨基酸产生相关的通路。花生四烯酸代谢途径的差异可能表明，不同地区黑叶猴的肠道微生物群已经进化出不同的策略来帮助宿主应对植物中的特定化学物质（如植物激素），这可能是其食性可塑性在微观层面的一种体现。花生四烯酸代谢途径是宿主与微生物免疫相互作用的核心界面。其丰度的差异可能受两个主要因素影响：一是饮食中脂质组成的差异，二是不同栖息地的环境压力（如病原体负荷和人为干扰程度）。该通路的显著分歧意味着大沙河和麻阳河黑叶猴种群的肠道微生物群可能已发生功能分化，以帮助宿主调节免疫平衡并应对局域环境挑战。
不同野生种群黑叶猴肠道微生物群与食性组成的相关性
微生物群对于从植物性饮食中提取能量和营养至关重要，并且可能促进了灵长类动物在应对快速环境变化时适应新的饮食生态位。多项研究表明，由栖息地引起的饮食和周围环境的改变对肠道微生物群有显著影响。在我们的研究中，通过Spearman相关分析观察到食性组成与肠道微生物群之间存在显著相关性。楠木属、飞龙掌血属（Toddalia）、蔷薇属（Rosa）和鹅耳枥属（Carpinus）与厚壁菌门和变形菌门的细菌相关性最强。这些植物可能含有不同的化合物，包括纤维、多糖和次生代谢物，这些物质可能选择性地促进与这些细菌门相关的微生物群落的增殖。这一观察结果意味着黑叶猴规律性摄入此类植物可能有助于维持一个以厚壁菌门和变形菌门为主的特定肠道微生态系统。
结论
本研究利用元条形码和16S rRNA测序技术，阐明了黑叶猴肠道微生物群的结构和功能变异及其与饮食习惯的关联。研究发现，不同区域之间以及同一区域内的不同猴群之间，栖息地的植物多样性都存在显著差异。然而值得注意的是，同一区域内不同猴群的黑叶猴，其食性组成和肠道微生物群表现出相当大的相似性，这表明它们能够通过饮食灵活性来适应环境变化。这些发现强调了栖息在中国贵州不同喀斯特生态系统中的种群在饮食结构和肠道微生物组成方面存在巨大差异，从而突出了饮食在促进宿主适应当地环境条件方面的关键作用。
