《International Journal of Food Properties》：Effects of thermal versus non-thermal microbial decontamination treatments on quality and bacterial community in prepared deboned chicken feet: a PacBio SMRT sequencing-assisted comparison
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本研究系统比较了热处理与非热处理技术对脱骨鸡爪产品的杀菌效果与品质影响，发现高压处理（HPP）在有效降低菌落总数（TVC）的同时，能更好地保持产品的质构特性（剪切力、MFI）与感官品质，并通过PacBio单分子实时测序揭示了不同处理方式对残留菌群结构的独特塑造作用，为高胶原肉类产品的减菌工艺选择提供了科学依据。
引言
即食食品在全球市场迅速普及，脱骨鸡爪（PDCF）作为一种富含胶原蛋白、质地独特的高附加值产品，市场需求巨大。中国是鸡爪的主要消费国与进口国，仅2024年就进口了约44.9万吨冷冻鸡爪。PDCF具有高水分、高蛋白（胶原蛋白约占总蛋白54%）、无防腐剂、依赖冷链等特点，使其在生产与贮藏过程中极易受到微生物污染，导致腐败变质，严重威胁食品安全并损害其核心的弹性质构。因此，寻找一种既能有效杀菌、延长货架期，又能最大限度保持产品质构的加工技术至关重要。当前肉类减菌技术主要分为热加工（如巴氏杀菌、微波）和非热加工（如电子束辐照、超声、高压处理）。传统热处理成本低、操作简单，但高温常导致质构劣变；巴氏杀菌温度较低，能更好地保持风味营养；微波兼具热与非热效应。非热加工技术能有效杀灭微生物并较好地保持甚至改善食品品质，如电子束辐照（EBI）利用高能电子束破坏微生物遗传物质，超声（US）依靠空化效应破坏细胞结构，高压处理（HPP）则通过破坏蛋白质结构实现高效灭菌并可能增强风味。目前，对肉类产品减菌后菌群的分析多依赖第二代测序技术，其读长短限制了鉴定准确性。相比之下，Pacific Biosciences（PacBio）单分子实时（SMRT）测序技术可获得16S rRNA基因全长序列，能更精确地揭示样品内的物种多样性。然而，应用PacBio SMRT测序研究PDCF减菌处理后微生物群落组成的工作尚少。准确识别减菌后的微生物群落对于评估处理效果和识别腐败或致病菌的潜在风险至关重要。需要强调的是，细菌多样性指数的降低并不等同于微生物安全性的提高，全面的安全性评估需综合考虑总活菌数、存活菌群的组成与相对丰度以及生物标志物。尽管各种减菌技术在肉类保鲜中已有广泛研究，但针对高胶原含量的PDCF的系统评估，特别是加工对其细菌群落影响的研究仍显不足。因此，本研究选取HTST、LTLT和MW作为热处理的代表，并辅以EBI、US和HPP三种非热处理，系统研究不同微生物减菌处理对PDCF品质和细菌群落的影响，旨在为PDCF及类似高胶原肉类产品选择高效低损的减菌处理提供科学依据，并为其微生物安全与品质稳定奠定理论基础。
材料与方法
真空包装的PDCF样品购自中国四川自贡一家本地食品公司，共21袋，每袋250克。样品在-18°C冷冻条件下快速运至实验室，并立即随机分为七组，每组三个样品：对照组（CG）、电子束辐照组（EBI）、超声处理组（US）、高压处理组（HPP）、高温短时巴氏杀菌组（HTST）、低温长时巴氏杀菌组（LTLT）和微波处理组（MW）。各方法的操作参数通过预实验并参考文献确定，旨在实现显著的微生物灭活同时保持鸡爪的感官和质构品质。处理后，所有样品在4°C冰箱中储存直至分析。
通过平板计数法测定总活菌数（TVC）。使用质构分析仪测量PDCF样品第三指第三节骨处的剪切力。肌原纤维碎片化指数（MFI）的测定参考已有方法并稍作修改。通过扫描电子显微镜（SEM）观察PDCF表面的微观结构。感官评价由20名经过培训的成员（10男10女，年龄20-30岁，平均24岁）自愿参与，对色泽、质地、外观、滋味、气味和总体可接受度进行评分，总感官评分为各属性的加权和。
使用试剂盒提取PDCF样品的基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop评估其质量与纯度。使用引物27F和1492R对16S rRNA基因全长进行PCR扩增，扩增产物纯化、定量后等量混合，使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0建库，并在PacBio Sequel II平台上进行测序。测序后，使用USEARCH将合格序列按97%相似度聚类为操作分类单元（OTUs），并在QIIME 2中使用基于SILVA数据库的朴素贝叶斯分类器进行物种注释。在QIIME 2中计算Alpha和Beta多样性，并通过单因素方差分析评估组间微生物丰度差异。此外，采用线性判别分析（LDA）和线性判别分析效应量（LEfSe）来识别差异丰度的分类单元。所有测序数据均在BMKCloud平台分析，并使用R软件生成图形输出。
三个生物学重复的数据通过SPSS 27.0进行单因素方差分析，随后进行Tukey’s HSD多重比较检验。在进行方差分析前，评估了数据的正态性和方差齐性。对于微生物群落相对丰度数据，我们认识到其组成性质，因此方差分析结果结合基于LEfSe的生物标志物分析进行解读。数据图形使用Origin 2024b生成。
结果与讨论
PDCF的总活菌数
总活菌数是评估减菌过程效果的关键指标。对照组的TVC为2.44 ± 0.12 log CFU/g。所有减菌处理均显著降低了TVC。其中，电子束辐照（EBI）表现最为有效，TVC仅为0.10 ± 0.03 log CFU/g，显著低于其他处理。这主要归因于EBI利用高能电子束穿透微生物细胞，破坏其DNA结构，从而阻止复制增殖。高压处理（HPP）的杀菌效果次之，TVC为0.39 ± 0.08 log CFU/g。该水平远低于报道的冷藏熟制禽肉产品腐败阈值（6-7 log CFU/g）以及中国国家标准（GB 2726-2016）对熟肉制品≤5 log CFU/g的限制。同样，超声（US）和热处理（HTST、LTLT、MW）的TVC也低于此限值。HPP通过高压处理对细胞结构造成不可逆损伤来实现微生物灭活。相比之下，US的效果不如EBI和HPP。据报道，US常与其他处理（如热或化学处理）结合使用以增强其效果，单独使用时效果有限。此外，热处理主要通过热诱导的酶和蛋白质损伤导致微生物死亡。在本研究中，微波（MW）的杀菌效果显著优于LTLT和HTST，这可能是由于其同时依赖于热效应和电场强度产生的非热效应。
剪切力与肌原纤维碎片化指数
PDCF特有的嫩度是其食用品质的关键决定因素。剪切力是评估肉类嫩度的常用指标，而MFI间接反映了肌原纤维结构的完整性，与嫩度密切相关。对照组的剪切力为1.09 ± 0.04 N。所有减菌处理均显著降低了剪切力，表明处理导致了PDCF的组织软化。总体而言，剪切力与MFI呈强负相关，表明加工过程中肌原纤维破碎的增加与质地变软直接相关。这与之前在冷冻鸡爪和羊肉中的观察结果一致，即较高的MFI伴随着仪器测量韧性的降低。
EBI处理后，PDCF的剪切力降至0.94 ± 0.03 N，而MFI增至24.8 ± 0.49。EBI组的剪切力和MFI值最接近对照组，表明其对PDCF嫩度的影响最小。相比之下，HPP处理将剪切力降至0.77 ± 0.01 N，并将MFI增至25.30 ± 0.35。与EBI、US、HPP等非热加工相比，所有热处理均导致剪切力显著下降、MFI显著增加，表明热处理对PDCF嫩度的保持有明显不利影响。这可能归因于热处理过程中严重的水分损失和蛋白质二级结构的改变，导致肌原纤维破碎增加，从而降低了剪切力。
扫描电子显微镜的微观结构分析
不同微生物减菌处理对PDCF表面微观结构的影响如图3所示。对照组表面呈现均匀分布、形态完整的突起，主要由肌纤维束和结缔组织构成。EBI处理后，突起保持最为完整，仅部分轻微融合，呈现不规则外观，整体形态与对照组非常接近。这种相对的结构完整性与其较高的剪切力表现一致。US导致突起数量显著减少，尺寸明显变小，同时表面孔隙增加。HPP引起突起轻微融合，排列更紧密，整体呈现压缩和致密化趋势。HTST导致突起广泛融合，形成聚集的块状结构，孔隙进一步扩大。LTLT处理后，突起基本消失，表面转变为由细小颗粒单元组成的结构，整体质地相对疏松。在MW处理中，突起几乎完全消失，留下相对光滑的表面和大量细小的孔隙，这可能是由于微波过热损伤了肌纤维。
总之，不同的微生物减菌处理对PDCF的微观结构造成了不同程度的损伤。EBI较好地保持了结构完整性，而HPP促进了结构致密化。通常，更完整的结构和更致密的肌纤维网络对应更高的肌肉韧性，可能导致更好的剪切力性能，以及改善的咀嚼性和弹性。相比之下，在US和热处理中观察到的微观结构改变，如突起消失、孔隙率增加和表面光滑化，可能是导致仪器测量剪切力下降、感官弹性降低和质地软化的关键因素。
PDCF的感官评价
不同的微生物减菌处理显著影响了PDCF的感官品质。在所有接受感官评价的减菌处理中，HPP在所有属性上均获得了最高分：色泽、质地、外观、滋味、气味和总体可接受度。因此，其总感官评分显著高于所有其他处理，并且最接近对照组。值得注意的是，尽管HPP的仪器测量剪切力显著低于EBI，但其质地评分却明显更高。这表明HPP诱导的适度质地软化并未超过PDCF的质地偏好阈值，反而落入了能综合优化嫩度、多汁性和弹性感知的理想范围。这种感官优势与微观结构和MFI值的变化相符。HPP处理导致MFI值适度增加以及肌原纤维蛋白轻微融合，共同促成了更受偏好的弹性和咀嚼性。此外，先前研究表明HPP有助于释放肉制品中的小分子风味化合物，从而增强香气和滋味，这进一步支持了其在滋味和气味类别中的较高得分。
在其他处理中，总感官评分未观察到显著差异。值得注意的是，在非热加工中，总分为7.31 ± 0.20的EBI在滋味和气味上得分最低，与对照组明显偏离。这与之前高剂量辐照可诱导酚类化合物分解和含硫氨基酸降解，形成具有特征性不良气味的挥发性硫化合物的报道一致。因此，尽管EBI在剪切力、MFI值和微观结构上保持得与对照组最相似，但强烈的不良气味仍导致总体可接受度降低。此外，US和热处理的质地评分普遍较低，这与其较低的剪切力、较高的MFI值和更明显的微观结构损伤一致。
Alpha多样性分析
本研究采用PacBio SMRT测序技术分析PDCF的细菌群落组成。稀疏曲线和香农指数曲线均趋于平缓，表明测序数据量充足且深度足够，可靠地捕获了PDCF中的微生物组成。所有样品的覆盖度均超过0.999，进一步证实测序结果能准确代表PDCF中的微生物群落。Alpha多样性用于评估微生物群落的丰富度和多样性。ACE和Chao1指数反映物种丰富度，数值越高表明物种数量越多。香农指数和辛普森指数用于评估物种多样性和均匀度，数值越高表明群落多样性越高，物种分布越均匀。
对照组的Chao1、ACE、香农和辛普森指数值最高，表明物种丰富度和多样性最大，反映了PDCF初始细菌群落结构的复杂性。相比之下，EBI显示出最低的Alpha多样性指数。等级丰度曲线的结果与此一致：对照组的曲线最平缓，横轴覆盖范围最广，表明物种分布相对均匀且丰富度高；而EBI的曲线陡峭且横轴范围窄，表明群落明显向极少数分类单元主导转变。这些存活的微生物可能具有抗辐射性或DNA损伤修复能力。HTST表现出第二低的Alpha多样性指数，其次是LTLT，而HPP、US和MW引起的群落丰富度和均匀度变化相对较小。
然而，Alpha多样性的降低并不等同于微生物安全性的提高，特别是当单一分类群成为主导时。相反，维持较高的Alpha多样性具有双重含义：它可能通过竞争排斥抑制致病菌，但也可能因容纳更多腐败菌而增加风险。因此，对多样性的解读应结合微生物负荷和特定群落组成的考量。随后的群落结构分析识别了各组中残留的和差异丰度的细菌属，为安全性评估提供了全面基础。
Beta多样性分析
主坐标分析（PCoA）用于评估Beta多样性，它反映了不同处理的脱骨鸡爪样品中微生物群落的结构差异。在PCoA图中，距离较近的样品在物种组成上更相似，而距离越大则表明差异越明显。如图所示，所有减菌处理都导致与对照组明显分离，证实处理显著改变了原始细菌群落。此外，不同减菌处理之间也存在明显的分离，表明技术对细菌群落产生了不同的影响。具体而言，LTLT、MW和US表现出相对相似的细菌群落结构。HPP似乎更接近对照组。需要注意的是，PCoA中观察到的HPP与对照组群落组成相似性较高，并不等同于微生物安全性改善。相比之下，EBI和HTST形成了独立的簇，表明它们的微生物结构与其他处理有显著不同。
细菌群落结构分析
本研究分析了不同微生物减菌处理下PDCF从门到属水平的细菌群落组成。共鉴定出6个细菌门。厚壁菌门是优势门，相对丰度在对照组为46.82%，EBI组为99.86%，US组为42.86%，HPP组为44.73%，HTST组为99.97%，LTLT组为95.11%，MW组为35.58%。变形菌门是第二优势门。变形菌门和厚壁菌门都被广泛报道为包括鱼、鸡和贝类在内的各种肉制品中的主要腐败微生物区系。结果表明，EBI、LTLT和HTST降低了变形菌门的相对丰度，同时保留了高比例的厚壁菌门，表明对变形菌门有更强的抑制作用。
图7B描述了不同处理后PDCF中前10位细菌属的相对丰度。对照组的微生物群落主要由肠杆菌属、库尔特氏菌属、漫游球菌属、乳球菌属和肠球菌属组成。所有处理都显著改变了微生物组成。EBI处理后，细菌群落几乎完全由葡萄球菌属（99.43%）主导，表明可能存在耐辐照菌株。US、HPP和MW都降低了肠杆菌属和库尔特氏菌属的相对丰度，但它们富集了不同的属：US富集了链球菌属和不动杆菌属，HPP富集了乳球菌属，MW富集了乳球菌属、链球菌属和不动杆菌属。在热处理中，HTST导致芽孢杆菌属绝对优势，而LTLT主要富集了肠球菌属和类芽孢杆菌属，这表明耐热菌的选择因温度而异。总之，微生物减菌处理不仅决定了微生物减少的效率，更关键的是塑造了残留细菌群落的组成。
通过LEfSe分析鉴定差异细菌分类单元
本研究使用线性判别分析效应量（LEfSe），以LDA得分大于4.5且p值小于0.05为标准，识别了不同处理间表现出显著差异的细菌分类单元，并生成了分支图。在分支图中，相同颜色的节点代表组间无显著差异的系统发育分类单元，而不同颜色的节点则表示在其对应处理组中显著富集的分类单元。节点大小与分类单元的丰度成正比。
在对照组中鉴定的生物标志物包括库尔特氏菌属、漫游球菌属和肠杆菌属。其中，库尔特氏菌属广泛分布于农场环境、动物粪便和肉制品中，是一种常见的环境微生物，通常不会导致肉类腐败。漫游球菌属常见于水生环境，是一种非典型人类病原体，也是已知的鱼类腐败菌。肠杆菌属既是经典病原体也是腐败菌，可导致真空包装肉类的胀袋腐败。这些属共同反映了PDCF中典型的环境指示菌和腐败微生物区系。如图所示，所有微生物减菌处理都有效抑制了此类微生物群。
每种微生物减菌处理也塑造了独特的残留微生物群落。EBI的生物标志物被鉴定为葡萄球菌属，其中巴氏葡萄球菌是优势种。作为广泛分布于食品加工环境中的机会性病原体，该菌的某些菌株可分泌脂肪酶或蛋白酶，从而对食品构成潜在的腐败风险。在US中，特征性分类单元是链球菌属和摩根氏菌属。链球菌属包含几个被认为是潜在病原体的物种，例如已知会引起腹泻等临床症状的路特链球菌。摩根氏菌属是一种机会性病原体。HPP的特征性分类单元是乳球菌属和气单胞菌属。尽管乳球菌被公认为安全（GRAS）并广泛用于食品发酵和防腐，但它也被确定为鸡肉中的主要腐败菌。此外，文献中偶有报道某些物种在极少数情况下可能表现出潜在的致病性。气单胞菌是冷藏肉制品中另一种典型的腐败菌，其某些菌株也表现出致病特性。
在热处理中，HTST主要富集了芽孢杆菌属，而LTLT则以肠球菌属和类芽孢杆菌属为主。HTST中的芽孢杆菌种群主要由蜡样芽孢杆菌组成，它具有腐败和致病能力，可导致食物中毒。肠球菌是一种机会性病原体，在LTLT中主要由屎肠球菌代表。类芽孢杆菌主要是一种环境微生物，关于其致病性或腐败活性的报道有限。MW的特征性分类单元是不动杆菌属，它也是一种机会性病原体，已被认为是真空包装熟肉制品中的优势腐败菌属。
不同微生物减菌处理后PDCF的微生物安全性评估
对TVC和细菌群落的综合分析揭示了各种微生物减菌处理对PDCF微生物安全性的显著不同影响。EBI导致最低的TVC和Alpha多样性；然而，其残留的微生物群落结构高度同质，几乎完全由葡萄球菌属主导，该属包含已知的潜在致病和腐败菌株。这进一步表明，Alpha多样性的降低并不一定意味着微生物安全性的提高，特别是当残留群落由特定分类单元主导时。同样，LTLT和HTST导致潜在危险菌属的大量富集；例如，芽孢杆菌在HTST中占群落比例高达93.86%，且处理后TVC仍保持在较高水平。US和MW在控制TVC方面效果有限，且其特征菌属大多与致病潜力相关。
相比之下，HPP在实现低TVC的同时，有效抑制了原有的优势腐败菌，且未出现任何单一潜在风险菌属绝对优势的情况。其主要差异标志菌属是乳球菌，同时伴有低丰度的气单胞菌。需要指出的是，尽管乳球菌常被报道通过产酸和竞争排斥机制抑制其他微生物，但不同菌株在贮藏过程中可能表现出不同的行为，在特定条件下仍可能参与腐败过程或影响产品货架期。总体而言，HPP在控制微生物负荷和限制潜在风险菌属过度增殖方面表现出相对平衡的性能。然而，其长期安全性和对货架期的具体影响，需要基于未来菌株水平的研究和贮藏实验进行更全面的评估。
结论
本研究系统评估了六种微生物减菌处理对PDCF品质特征和细菌群落结构的影响。在品质属性方面，所有处理均显著降低了TVC，但在保持产品质构和感官品质方面表现出显著差异。EBI处理达到了最低的TVC，且对产品质构和微观结构的损伤最小；然而，潜在的辐照异味严重影响了感官可接受度。HPP实现了第二低的TVC，保持了适当的剪切力、MFI和微观结构，并获得了最高的感官评分。相比之下，热处理和US导致剪切力显著下降、微观结构明显损伤、质地软化以及感官品质显著降低。在细菌群落结构方面，PacBio SMRT全长测序分析揭示，不同处理对微生物群落施加了差异化的选择压力。EBI和HTST施加的选择压力最强，导致群落结构高度简化，分别由葡萄球菌属和芽孢杆菌属主导。LTLT主要富集肠球菌属和类芽孢杆菌属，US富集链球菌属和摩根氏菌属，MW富集不动杆菌属。这些优势菌属大多与产品腐败或潜在致病性相关。相比之下，HPP有效抑制了初始的优势腐败菌，且未导致残留微生物群落被单一具有潜在风险的菌属绝对主导，其主要生物标志物为乳球菌属。综上所述，HPP在确保微生物安全性和保持产品质量之间取得了最佳平衡，是PDCF推荐的减菌方法。虽然HPP的初始投资高于传统热处理，但其卓越的品质保持能力显著提升了其工业可行性，特别是对于PDCF这类高价值、富含胶原蛋白的产品。随着技术进步和规模化生产，其经济可行性有望进一步提高。本研究结果不仅为优化PDCF的减菌方案提供了科学依据，也为高胶原肉制品的微生物控制与品质保持奠定了理论基础。
