《Journal of Natural Products》：Genetic Dereplication of Multiple Penicillium expansum Biosynthetic Gene Clusters Reveals Cryptic Penta-Cyclopeptide Production
编辑推荐：
本综述推荐使用一种创新的“基因去重复”策略，即通过靶向敲除主要次级代谢产物（SM）的生物合成基因簇（BGC），为揭示真菌中隐藏的或沉默的（cryptic）新型天然产物提供了强大平台。文中以扩展青霉（Penicillium expansum）为模型，成功构建了一个缺失五种主要毒素（如棒曲霉素patulin）的“平线”（flatline）菌株，结合一株多化合物（OSMAC）培养技术，发现并表征了含有非蛋白源氨基酸哌啶酸（Pip）的新颖环五肽，并将其生物合成关联至特定的非核糖体肽合成酶（NRPS）基因mbjA。这项研究将基因型与化学表型直接关联，验证了该策略在挖掘真菌隐秘代谢潜力方面的有效性。
遗传去重复导致扩展青霉五种主要次级代谢产物生物合成途径的缺失
通过靶向删除负责产生棒曲霉素（patulin）、桔霉素（citrinin）、roquefortine C、andrastin A 和 communesins 的关键生物合成基因，研究人员成功构建了一个扩展青霉（Penicillium expansum）的“平线”（flatline）菌株TJLE34。液质联用（LC-MS/MS）分析证实，该菌株在标准实验室条件下不再产生上述五种主要的霉菌毒素及其类似物，从而极大地简化了其代谢谱，为检测原本被掩盖的微量化合物创造了有利条件。这一基因去重复（Genetic dereplication）策略借鉴了先前在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）等真菌中成功的经验，旨在通过消除主要代谢物来降低代谢背景的复杂性。
OSMAC方法揭示了平线菌株中独特代谢物产量的增加
为了充分挖掘平线菌株的次级代谢潜力，研究采用了“一株多化合物”（OSMAC）方法，在15种不同的固体培养基上培养野生型和平线菌株。代谢组学分析发现，在谷物类培养基（特别是大米培养基）上，平线菌株的次级代谢物多样性显著增加。例如，四环倍半萜内酯expansolides A和B的丰度增加了近2倍。通过全球天然产物社会分子网络（GNPS molecular networking）分析，研究人员锁定了一个由16个节点组成的分子家族，其中包含三个质荷比（m/z）分别为580.2964、550.2860和564.3014的未知代谢物，它们无法在GNPS中被去重复化。碎片分析表明这些是含有非常见氨基酸哌啶酸（pipecolic acid, Pip）的相关肽类，凸显了其新颖性。由于它们在大米培养基中丰度较高且结构独特，被选定为分离和生物合成基因簇表征的目标。
分离与结构鉴定引领新环肽1和2的发现
通过发酵、提取和多步色谱分离，从平线菌株的大米培养物中获得了化合物1和已知化合物MBJ-0110（3）。高分辨质谱（HR-ESI-MS）和核磁共振（NMR）波谱分析确定了它们的分子式。化合物1被鉴定为一种新的MBJ-0110衍生物，其分子式为C27H41N5O9。详细的二维核磁共振分析（包括COSY、HMBC、ROESY）揭示了其结构包含五个氨基酸残基：β-羟基异亮氨酸（hydroxy-Ile）、哌啶酸（Pip）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）和γ-羟基哌啶酸（hydroxy-Pip）。其中，羟基化发生在异亮氨酸的C-3位，这是一个在真菌肽类中罕见的修饰位点。通过碱性水解和质谱分析，确定了其线性肽序列为：hydroxy-Ile–Pip–Pro–Asp–hydroxy-Pip。利用先进的Marfey方法，确定了其中Pro、Pip和Asp的绝对构型均为L型。基于此，化合物1被命名为3-羟基-MBJ-0110。此外，通过分子网络和质谱碎片分析，鉴定出另一个新类似物化合物2，其分子式显示比MBJ-0110少一个CH2基团，碎片图谱表明异亮氨酸（Ile）被缬氨酸（Val）取代，因此被命名为Val-MBJ-0110。这些环肽属于环酯肽（cyclic depsipeptide），其特征是含有一个由羟基哌啶酸的羟基与相邻氨基酸的C末端羧基形成的酯键（内酯键），而非更常见的酰胺键，这增加了其化学独特性。
NRPS MbjA负责环肽1–3的生产
为了找到负责合成这些五残基环肽的生物合成基因簇，研究人员利用antiSMASH对扩展青霉基因组进行了预测，发现了21个编码非核糖体肽合成酶（NRPS）的区域。进一步使用PARAS工具分析，筛选出两个分别具有5个和6个预测腺苷化（A）结构域的NRPS基因（PEXP_055140和PEXP_085540）。通过在平线菌株背景中分别删除这两个基因并进行代谢谱分析，发现删除PEXP_055140（命名为mbjA）的菌株完全丧失了生产环肽1-3的能力，从而确认了MbjA是合成这些环肽的核心生物合成酶。
MbjA NRPS在远缘分类群中广泛存在，但其基因簇在青霉属内具有特异性
尽管mbjA编码的NRPS理论上足以生物合成环肽的骨架，但非蛋白源前体（如L-哌啶酸）的起源尚不清楚。研究从两个层面进行了进化保守性分析。首先，假设完整的mbj基因簇是生物合成所必需的，利用cBlaster进行同源基因簇搜索，发现该基因簇在青霉属（Penicillium）内具有较高的基因组共线性，但并非该属所有物种都拥有。其次，假设mbjA可能独立起作用或与基因组远端修饰酶合作，通过BLASTp、synthaser和PARAS进行广泛搜索，发现了30个独特的MbjA同源蛋白，分布于19个不同物种。这些同源物主要存在于散囊菌纲（Eurotiomycetes）（如曲霉属、青霉属、篮状菌属），但也存在于少数粪壳菌纲（Sordariomycetes）（如木霉属）和一个座囊菌纲（Dothideomycetes）物种中。值得注意的是，所有含有mbjA同源物的基因组都只存在一个拷贝。对A结构域底物特异性的预测显示，大多数同源物（20个）的五个模块的预测特异性与参考MbjA完全相同，表明它们是功能上的直系同源物。这种在远缘分类群中的分布模式暗示了可能的水平基因转移事件或古老基因家族的特定谱系丢失。
在mbjA所在的基因簇中，并未预测到负责将L-赖氨酸转化为L-哌啶酸的环化脱氨酶（如RapL）。相反，其相邻基因PEXP_055150被预测为双加氧酶/2-酮戊二酸铁（II）氧合酶（2OG-Fe(II) oxygenase），可能负责催化L-哌啶酸的羟基化以形成羟基-L-哌啶酸，或催化异亮氨酸的羟基化。关于环肽的环化机制，可能由NRPS组装线末端的标准硫酯酶（TE）结构域介导，也可能由整合在NRPS中的特殊缩合（C）结构域完成，类似于destruxin合成酶DtxS1的机制。
结论
总之，通过消除五种主要代谢物途径，研究人员在标准实验室条件下为扩展青霉创建了一个更“洁净”的化学背景。这种基因去重复策略，结合OSMAC方法，成功发现了含有羟基哌啶酸和羟基异亮氨酸等非常见氨基酸的新环肽衍生物，并鉴定出其核心生物合成基因mbjA。该基因展现出的底物灵活性（可容纳Val或Ile）凸显了该途径产生化学多样性的潜力。这些发现首次为这类罕见环肽家族提供了直接的基因型-化学表型关联证据，为挖掘其他隐藏的真菌化学生物合成潜力打开了大门。
