甜叶菊（Stevia rebaudiana）中SrUGT85C2基因的功能研究及其序列变异

《BMC Plant Biology》：Functional study and sequence variation of the SrUGT85C2 genes in Stevia rebaudiana

甜叶菊高甜苷类物质代谢调控研究揭示SrUGT85C2关键酶的突变体对糖基化效率的影响，分子对接显示K25H和E418G突变分别提升13-羟基和19-羟基糖基化活性达164.1%和203.6%，N02-1/N02-5/023-3通过氢键网络增强催化，N05-5/N02-6因口袋构象改变丧失活性。该成果为甜叶菊功能基因组学和微生物发酵工程优化提供理论支撑。

　　

摘要

Stevia rebaudiana Bertoni 被认为是第三大天然甜味来源，因为其叶片富含高甜度、低热量的甜菊糖苷（SGs）。在甜菊糖苷的代谢糖基化过程中，一种关键的酶——尿苷二磷酸糖基转移酶 SrUGT85C2 负责催化甜菊醇（steviol）的 C₁₃-羟基的糖基化反应，生成 β-D-葡萄糖苷和 13-甜菊醇单苷。然而，SrUGT85C2 酶的关键残基及其对 S. rebaudiana 中甜菊糖苷积累的影响仍不清楚。在这项研究中，我们对 10 种具有不同甜菊糖苷组成的 S. rebaudiana 基因型进行了 SrUGT85C2 基因序列的克隆和功能分析。通过序列分析，发现了 11 种该基因的变异体。其中，突变体 N05-5 和 N02-6 由于单个氨基酸的替换，导致底物结合能力和酶活性口袋构象发生变化，从而阻碍了反应物质的接近。分子对接分析表明，突变体 N02-1、N02-5 和 N02-3 可能通过形成额外的氢键提高了甜菊醇的转化效率。由于甜菊醇-19-O-葡萄糖苷（19-SMG）和 UDP-葡萄糖（UDPG）在空间上存在重叠，突变体 11-14-5 和 N01-1 阻断了 C₁₉ 位的糖基化反应。基于分子对接的定点突变实验验证，突变蛋白 K25H 和 E418G 分别使甜菊醇和 19-SMG 的催化活性提高了 164.1% 和 203.6%。此外，对各基因型中 SrUGT85C2 的表达分析显示，该基因的表达水平存在显著差异，其中 GP 基因型的表达量最高。K25 和 E418 也被发现是有效的正向突变位点，这为生产优质 S. rebaudiana 材料以及高效微生物合成最佳甜菊糖苷提供了理论基础。

Stevia rebaudiana Bertoni 被认为是第三大天然甜味来源，因为其叶片富含高甜度、低热量的甜菊糖苷（SGs）。在甜菊糖苷的代谢过程中，一种关键的酶——尿苷二磷酸糖基转移酶 SrUGT85C2 负责催化甜菊醇（steviol）的 C₁₃-羟基的糖基化反应，生成 β-D-葡萄糖苷和 13-甜菊醇单苷。然而，SrUGT85C2 酶的关键残基及其对 S. rebaudiana 中甜菊糖苷积累的影响仍不清楚。在这项研究中，我们对 10 种具有不同甜菊糖苷组成的 S. rebaudiana 基因型进行了 SrUGT85C2 基因序列的克隆和功能分析。通过序列分析，发现了 11 种该基因的变异体。其中，突变体 N05-5 和 N02-6 由于单个氨基酸的替换，导致底物结合能力和酶活性口袋构象发生变化，从而阻碍了反应物质的接近。分子对接分析表明，突变体 N02-1、N02-5 和 N02-3 可能通过形成额外的氢键提高了甜菊醇的转化效率。由于甜菊醇-19-O-葡萄糖苷（19-SMG）和 UDP-葡萄糖（UDPG）在空间上存在重叠，突变体 11-14-5 和 N01-1 阻断了 C₁₉ 位的糖基化反应。基于分子对接的定点突变实验验证，突变蛋白 K25H 和 E418G 分别使甜菊醇和 19-SMG 的催化活性提高了 164.1% 和 203.6%。此外，对各基因型中 SrUGT85C2 的表达分析显示，该基因的表达水平存在显著差异，其中 GP 基因型的表达量最高。K25 和 E418 也被发现是有效的正向突变位点，这为生产优质 S. rebaudiana 材料以及高效微生物合成最佳甜菊糖苷提供了理论基础。