《Archives of Virology》：Monensin and salinomycin exhibit broad-spectrum antiviral activity against enteroviruses by disrupting lysosomal acidification
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本文聚焦肠道病毒感染的防治难题，揭示了传统兽用离子载体抗生素——莫能菌素（MON）和盐霉素（SAL）——可通过中和内溶酶体pH值，靶向病毒进入和成熟两个关键阶段，从而抑制包括EV71在内的多种肠道病毒。这项研究为缺乏特效药的肠道病毒感染提供了新型广谱抗病毒策略。
在病毒家族中，肠道病毒（Enteroviruses, EVs）是一个庞大而活跃的群体，它们隶属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），成员包括导致普通感冒的鼻病毒（Rhinoviruses）、引发心肌炎的柯萨奇病毒（Coxsackieviruses），以及近几十年来在亚太地区引发关注的肠病毒71型（EV71）等。大多数肠道病毒感染症状轻微甚至无症状，但它们也可能引发严重疾病，如脑炎、脑膜炎、急性弛缓性麻痹等，对婴幼儿威胁尤甚。其中，EV71是引发手足口病（Hand, Foot, and Mouth Disease）重症和死亡的主要病原体。尽管有针对EV71和脊髓灰质炎病毒的疫苗，但由于肠道病毒血清型众多，为所有类型研发疫苗极具挑战性。更严峻的是，目前临床上没有批准用于治疗肠道病毒感染的特效抗病毒药物。因此，寻找和开发能够应对多种血清型的广谱抗病毒药物，成为了迫切的科学需求。
在这一背景下，研究人员将目光投向了兽医领域——离子载体抗生素。这类抗生素，如莫能菌素（Monensin, MON）和盐霉素（Salinomycin, SAL），是小型疏水性分子，通常作为抗球虫饲料添加剂使用。有趣的是，既往研究提示它们对包括人巨细胞病毒、流感病毒甚至SARS-CoV-2在内的多种病毒有抑制活性，但其具体作用机制尚不完全清楚。那么，这些在动物身上使用的“老药”，能否成为对抗人类肠道病毒的“新武器”？它们又是如何起作用的呢？为了回答这些问题，研究团队在《Archives of Virology》上发表了一项深入的研究。
为了探索MON和SAL的抗病毒效果与机制，研究人员运用了一系列关键的细胞与分子生物学技术。他们以人横纹肌肉瘤（RD）细胞为模型，培养并扩增了包括EV71、柯萨奇病毒A16型（CVA16）、B3型（CVB3）和埃可病毒9型（Echo 9）在内的多种肠道病毒。实验首先通过蛋白质免疫印迹（Western blot）和TCID50（半数组织培养感染剂量）测定法，评估了化合物抑制病毒蛋白表达和病毒滴度的能力，并计算了半数抑制浓度（IC50）和半数细胞毒性浓度（CC50）以确定选择指数（SI）。为了确定化合物作用的具体阶段，他们设计了时间添加实验（Time-of-addition assay）。通过病毒结合与内化实验，并结合逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测病毒RNA水平，排除了药物影响病毒吸附和内吞的可能性。为了验证其核心假设——药物通过碱化酸性细胞器（如溶酶体）来抑制病毒，研究团队使用了LysoTracker Red荧光染料对酸性囊泡进行染色和成像，直观地观察了药物处理后细胞内pH值的变化。此外，他们设计了低pH暴露实验，模拟病毒进入所需的酸性环境，以观察在酸性条件下药物的抗病毒效果是否被逆转。最后，他们还利用免疫荧光实验（Immunofluorescence assay, IFA）评估了这两种化合物对多种肠道病毒血清型的广谱抑制效果。
MON和SAL的化学结构及其抗病毒效力
研究显示，MON和SAL在结构上都属于聚醚离子载体。在RD细胞中，两者对EV71都表现出剂量依赖性的抑制效果，能有效降低病毒蛋白水平。细胞毒性实验表明，在有效抗病毒浓度下（≤10 μM），药物无明显细胞毒性。通过TCID50测定法，研究人员计算出MON和SAL对EV71的IC50分别为0.25 μM和1.49 μM，其选择指数（SI）分别为139.84和28.13，表明它们具有较高的安全窗口和特异的抗病毒活性。
MON和SAL靶向病毒进入阶段，不依赖于病毒结合与内化
时间添加实验的结果表明，MON和SAL主要在病毒感染的进入阶段发挥抑制作用。进一步的病毒结合与内化实验则证实，这两种药物并不影响病毒与细胞表面的结合，也不影响病毒被细胞吞入（内化）的过程。
MON和SAL中和了pH依赖性的病毒进入过程
作为单价阳离子离子载体，MON和SAL能跨膜运输钠离子或钾离子以交换质子，从而破坏酸性细胞器（如内溶酶体）的质子梯度。使用LysoTracker染色的实验直观地证明，这两种药物能以剂量依赖的方式显著降低酸性囊泡的荧光强度，即有效地中和了其内部的酸性环境。随后的低pH暴露实验提供了更直接的证据：当在病毒进入的关键时期，将细胞暴露于酸性培养基（pH 5.0）中，可以部分恢复被MON或SAL抑制的病毒感染；而在pH 6.5条件下则无明显恢复。这共同表明，药物是通过碱化细胞内的酸性环境（特别是后期溶酶体阶段）来阻止病毒进入的。
MON和SAL对病毒成熟的阻断
在病毒复制周期的后期，病毒结构蛋白VP0需要在酸性环境中被切割成VP2和VP4，才能使病毒颗粒成熟并具有感染性。研究人员在病毒感染后期（感染后9小时）加入MON或SAL，发现它们能以剂量依赖的方式抑制VP0到VP2的切割。这表明，除了抑制进入，这两种药物还能通过破坏病毒成熟所需的酸性环境，来阻断病毒的生命周期。
抗病毒谱
研究进一步将测试范围扩大到CVA16、CVB3和Echo 9等其他肠道病毒血清型。免疫荧光实验结果表明，MON和SAL对所有这些测试的血清型均显示出抗病毒活性，其中MON具有更低的IC50和更高的选择指数。这证实了它们作为广谱抗肠道病毒药物的潜力。
综上所述，本研究揭示了莫能菌素（MON）和盐霉素（SAL）这两种聚醚离子载体抗生素对抗肠道病毒的双重作用机制。它们不仅通过中和内溶酶体的酸性环境来阻断病毒进入细胞，还通过破坏病毒成熟后期所需的酸性囊泡环境来抑制子代病毒颗粒的产生。这种作用机制不依赖于病毒与细胞的结合或内吞过程，而是靶向宿主细胞中一个关键的、病毒普遍依赖的生理过程——酸性pH环境。因此，MON和SAL展现出了针对多种肠道病毒血清型的广谱抗病毒活性，其中MON展现出更优的效力与安全性指标（更高的选择指数）。
这项研究的意义重大。首先，它为目前缺乏有效治疗药物的肠道病毒感染，尤其是可能致命的EV71感染，提供了一种全新的、基于“老药新用”（Drug Repurposing）的治疗策略。其次，研究揭示的作用机制——靶向宿主细胞的酸性环境而非病毒本身——意味着病毒不太容易通过突变产生耐药性，这为解决抗病毒药物的耐药性问题提供了新思路。此外，鉴于许多其他病毒（如流感病毒、冠状病毒）的进入和/或成熟过程也依赖于酸性细胞器环境，本研究提出的“通过中和内溶酶体pH实现广谱抗病毒”的策略，可能具有更广泛的适用性，为应对未来可能出现的新发病毒疫情提供了一种潜在的技术储备。
当然，将MON和SAL应用于临床抗病毒治疗仍面临挑战，例如需要进一步提高其水溶性和生物利用度，并降低潜在的全身性毒性。未来，借助纳米载体等新型药物递送技术，或许能优化这些化合物的药代动力学特性，增强其靶向性和治疗效果。总之，这项研究不仅深化了我们对离子载体抗生素抗病毒机制的理解，也为开发下一代广谱抗病毒药物指明了有希望的方向。
