《Journal of Plant Growth Regulation》：cis-Zeatin is an Active Cytokinin that Mediates Gene Expression and Delays Leaf Senescence in Tomato Under Salt Stress
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本研究针对盐胁迫加速叶片衰老这一农业生产关键问题，聚焦于植物激素细胞分裂素（CK）中被研究较少的顺式玉米素（cZ）。研究人员通过生理学和转录组学分析，系统探究了cZ在盐胁迫下调控番茄叶片衰老的功能。结果显示，盐胁迫会加速叶片衰老，而外源施加cZ及其异构体反式玉米素（tZ）均能显著延缓这一过程，维持光合系统II效率（Fv/Fm）和叶绿素含量。尤为重要的是，转录组分析发现cZ能独特地调控众多与盐胁迫相关的信号通路和调控网络基因，包括部分与tZ调控方向相反的基因。加权基因共表达网络分析（WGCNA）进一步揭示了响应cZ和盐胁迫的协同调控模块。这项研究首次在番茄成熟叶片中证实cZ是一种具有生物活性的CK形式，其在盐胁迫下通过调控基因表达延缓叶片衰老，为理解植物适应非生物胁迫的细胞分裂素介导机制提供了新视角，并强调了cZ在植物抗逆策略中的重要性。
想象一下，番茄作为全球最重要的果蔬作物之一，却常常在田间地头面临“咸”的威胁。土壤盐渍化，这个由于不合理灌溉、化肥使用及环境因素导致的问题，正严重制约着番茄的产量。盐分不仅会在短期内对植物造成渗透胁迫，长期作用更会导致离子毒害，加速叶片衰老，让本该绿意盎然的叶子提前变黄、功能衰退。在植物应对逆境、延缓衰老的复杂网络里，细胞分裂素（Cytokinin, CK）扮演着至关重要的角色。它如同植物的“青春素”，在抵抗包括盐分在内的多种非生物胁迫中发挥着保护作用。然而，CK家族并非铁板一块，它由多种形式组成，其中广为人知的是反式玉米素（trans-Zeatin, tZ），而它的“孪生兄弟”——顺式玉米素（cis-Zeatin, cZ），虽然同样天然存在，却因在经典生物测定中活性较低、检测方法曾有限制等原因，长期被忽视，其功能尤其是与逆境响应的关联一直是个知识盲区。此前有研究发现，番茄幼苗在盐胁迫下cZ水平会显著上升，这暗示cZ可能与盐胁迫响应密切相关。那么，在成熟叶片面临盐胁迫诱导衰老的关键时刻，cZ究竟扮演着什么角色？它是否和tZ一样，能有效延缓衰老？其内在的分子机制又是如何？为了揭开这些谜团，一篇发表在《Journal of Plant Growth Regulation》的研究应运而生，为我们深入理解cZ在植物抗盐胁迫中的作用提供了有力的证据。
为了探究上述问题，研究人员采用了一套结合生理表型、分子报告系统和多组学分析的综合研究策略。研究以番茄（Solanum lycopersicum）野生型品种Micro-Tom（MT）为主要材料。核心实验是黑暗诱导的叶片衰老生物测定，研究人员从成熟叶片获取叶圆片，在不同浓度cZ或tZ处理下，施加或不施加150 mM氯化钠（NaCl），模拟盐胁迫与衰老条件。通过测量光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）和叶绿素含量来量化叶片衰老的生理状态。同时，利用携带细胞分裂素响应报告基因（pTCSn::VENUS）的番茄品系，在根尖直观观测盐和CK处理对CK信号通路活性的影响。在分子机制层面，研究进行了转录组（RNA-seq）分析，对上述不同处理的叶圆片在早期（2小时）和晚期（72小时）时间点进行取样、测序，通过差异表达基因（Differential Expressed Genes, DEGs）分析、基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析、加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）等手段，系统解析了cZ和tZ调控的基因网络、信号通路及其与盐胁迫的互作关系。部分关键差异表达结果通过实时定量PCR（qRT-PCR）进行了验证。
研究结果
顺式玉米素可延缓盐胁迫下的番茄叶片衰老
研究人员首先确定了在盐胁迫下有效的CK浓度。剂量响应曲线显示，在150 mM NaCl存在下，cZ和tZ处理均能浓度依赖性地提高叶片Fv/Fm值，其中1 μM浓度效果最显著且稳定，因此被用于后续所有实验。生理分析表明，盐处理单独作用会显著降低Fv/Fm和叶绿素含量，证实盐胁迫加速了黑暗诱导的叶片衰老。然而，无论是cZ还是tZ处理，都能在有无盐胁迫的条件下维持更高的Fv/Fm和叶绿素水平。有趣的是，在盐胁迫下，cZ处理在维持叶绿素含量方面比tZ更为有效。这些生理数据共同证明，cZ和tZ都具有延缓盐胁迫诱导的叶片衰老的活性，且cZ在保护光合色素方面可能具有独特优势。
顺式玉米素在盐胁迫下诱导细胞分裂素信号
为了验证cZ是否能激活CK信号通路，研究利用了pTCSn::VENUS报告株系。在根尖观察发现，单独的盐处理会随时间降低基础的CK报告基因荧光信号。然而，外源施加cZ或tZ后，无论是否存在盐胁迫，都能诱导并维持较强的荧光信号，且两者效果相当。这一结果表明，cZ能够像tZ一样有效激活CK信号响应，即使在盐胁迫环境下也是如此，这为其后续在叶片中发挥生理功能提供了分子层面的支持。
转录组分析揭示盐和时间的强烈效应
对处理叶片的转录组分析显示，基因表达模式主要受处理时间和盐胁迫有无的影响。主成分分析（PCA）将样品清晰地分为[2小时±NaCl]和[72小时±NaCl]四组。盐胁迫显著增加了差异表达基因（DEG）的数量，从2小时的1184个激增至72小时的7224个，说明盐胁迫在转录水平上强烈地加速了衰老进程。早期（2小时）响应的基因多与渗透调节、离子转运和早期激素信号（如ABA、JA）相关，而晚期（72小时）则大量激活了与转录调控、离子毒害响应和细胞死亡等相关的基因。
顺式玉米素在长期盐胁迫下调控更多差异表达基因
比较cZ和tZ调控的DEG数量发现，在没有盐胁迫时，tZ调控的DEG始终多于cZ。然而，在盐胁迫下，情况发生了有趣的变化：在72小时这个晚期时间点，cZ调控的DEG数量（3319个）反而超过了tZ（2912个）。这表明在应对长期的盐胁迫时，cZ可能扮演着越来越重要的转录调控角色。
顺式玉米素展现出与反式玉米素共通且独特的基因调控模式
通过比较cZ和tZ调控的DEG集合，研究发现两者在很大程度上重叠，特别是在调控核心CK信号通路基因（如组氨酸激酶受体SlHK4、响应调节因子SlRRs）方面。这证明cZ能激活经典的CK信号响应。然而，cZ也调控了大量独特的基因。基因本体（GO）富集分析显示，超过60%在盐胁迫72小时富集的GO条目是cZ独特调控的，涉及代谢过程（如叶绿素、活性氧）、蛋白质转运、RNA加工、氧化应激响应等多个方面，而tZ独特调控的则少得多（约10%）。这强烈提示cZ可能通过更广泛的细胞通路网络来应对盐胁迫。
顺式玉米素与盐胁迫对关键基因常呈现反向调控
深入分析发现，cZ的调控常常与盐胁迫的效应相反，起到一种“纠偏”或保护作用。例如，多个光合作用相关基因（如编码光合NDH亚复合体B2的基因）在盐胁迫下被强烈抑制，却在cZ加盐处理中被显著诱导。类似的反向调控模式也出现在一些衰老相关基因（SAGs）和激素信号基因（如与生长促进相关的生长素、赤霉素信号基因，以及与衰老促进相关的乙烯、ABA信号基因）上。这表明cZ可能通过逆转盐胁迫造成的部分有害转录重编程来延缓衰老。
顺式玉米素与反式玉米素在盐胁迫下存在拮抗性基因调控
尽管cZ和tZ的调控方向大多一致，但在盐胁迫72小时，研究人员发现了约80个基因受到两者的拮抗调控（即一个上调，另一个下调）。例如，一个CK信号负调控因子SlRR9在cZ处理下上调，而在tZ处理下下调。这些拮抗调控的基因涉及蛋白质周转、转录调控、细胞器功能等多个过程，提示这两种CK异构体在精细调整盐胁迫响应时可能具有某些互补甚至对立的功能。
加权基因共表达网络分析揭示协同调控模块
WGCNA分析将基因划分为50个共表达模块。其中，MEdarkmagenta、MEwhite等多个模块在cZ加盐72小时处理中表现出较高的特征基因值，意味着这些模块中的基因被cZ特异性协同激活。模块-性状相关性分析进一步指出，MEgreenyellow等模块与处理时间、盐胁迫和激素处理均显著相关。这些模块富集了CK生物合成、信号转导、光合作用以及激素相关基因，描绘出一个由cZ介导的、应对盐胁迫的协同转录调控网络蓝图。
研究结论与讨论
本研究通过系统的生理学和转录组学分析，首次在番茄成熟叶片中明确证实，顺式玉米素（cZ）是一种具有生物活性的细胞分裂素形式，能够有效延缓盐胁迫诱导的叶片衰老。其保护作用体现在维持光合系统II效率和叶绿素含量等生理指标上。
研究揭示了cZ作用的分子机制具有多面性：1）它能激活经典的细胞分裂素双组分信号系统（TCS）通路；2）它调控了大量独特且广泛的基因网络，涉及代谢、胁迫响应、转录调控等多个生物学过程，这些调控在很大程度上与盐胁迫造成的基因表达变化方向相反，起到了保护性调节作用；3）在长期盐胁迫下，cZ调控的转录程序规模甚至超过了其高活性异构体tZ，提示其在持续逆境适应中可能具有特殊重要性；4）cZ与tZ在调控大部分基因时方向一致，但也存在一部分拮抗调控的基因，表明CK家族内部在微调盐胁迫响应时存在功能分工。
这些发现填补了关于cZ在植物盐胁迫响应中功能的知识空白，将cZ从一个被忽视的CK形式提升为植物抗逆策略中的一个关键潜在调节因子。它不仅拓展了我们对细胞分裂素生物学功能多样性的认识，也为未来通过遗传改良或外源应用cZ及其相关通路来增强作物耐盐性提供了新的理论依据和潜在靶点。这项研究强调了在探究植物激素功能时，关注其不同化学形式特异性作用的重要性。
