《Journal of Plant Pathology》：First report of melon and cucumber plants as natural hosts of cowpea mild mottle virus
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本刊编辑推荐：为应对白粉虱传播病毒病对巴西重要经济作物甜瓜造成的危害，研究人员针对表现黄化、花叶和斑驳症状的葫芦科植物，开展了病毒鉴定与基因组研究。通过高通量测序（HTS）和RT-PCR技术，首次在全球范围内证实了甜瓜和黄瓜是豇豆轻斑驳病毒（CPMMV）的自然寄主，其外壳蛋白（CP）与巴西本地分离株的氨基酸序列同源性高达99.7%。这一发现揭示了CPMMV在葫芦科作物间存在跨物种传播的潜在流行病学风险，对病害监测与防控具有重要意义。
在巴西，甜瓜是一种重要的经济作物。然而，由白粉虱传播的病毒病频繁地影响甜瓜生产，造成经济损失。其中，一些病毒导致植株出现叶片黄化、花叶和斑驳等症状，严重影响作物的产量和品质。尽管已知多种病毒可侵染葫芦科作物，但对于特定病毒，尤其是豇豆轻斑驳病毒（Cowpea mild mottle virus, CPMMV）在甜瓜和黄瓜等主要葫芦科作物上的自然发生情况，此前在全球范围内尚未有明确的科学报道。因此，识别并确认田间发病植株的病原，对于理解病害的流行规律和制定有效的防控策略至关重要。
为了探究可能引致甜瓜严重病害的病毒发生情况，研究人员于2022年9月，在巴西马托格罗索州的锡诺普市，从商业田间采集了表现黄化、花叶和斑驳症状的葫芦科植株。这些样本随后被分为三个混合样本池进行分析：第一个混合池包含甜瓜、黄瓜和西印度小黄瓜；第二个混合池包含南瓜属（Cucurbitaspp.）植物；第三个混合池则包含其他属的植物，如西瓜和佛手瓜。研究人员从半纯化的混合样本中提取RNA，并采用高通量测序（High-throughput sequencing, HTS）技术进行分析。cDNA文库使用TruSeq Stranded Total RNA试剂盒构建，并在Novaseq 6000平台上进行测序，获得了约8800万条150 bp的双端读长。通过BLASTx分析，研究人员发现了与CPMMV具有高氨基酸序列相似性的重叠群。
为了进一步鉴定CPMMV的寄主物种，研究人员使用针对CPMMV运动蛋白编码区（TGB region）的特异性引物，对三个混合样本池的RNA提取物进行了逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。结果表明，CPMMV仅在包含甜瓜和黄瓜的Cucumis属混合样本中被检测到。在田间，约5%的甜瓜植株（调查1000株）和3%的黄瓜植株（调查500株）表现出花叶、斑驳和黄化症状。研究人员从这些病株中分别采集了12份甜瓜样本和6份黄瓜样本进行HTS分析。通过对这些单独存储的样本进行RT-PCR检测，确认其中3份甜瓜样本和1份黄瓜样本呈CPMMV阳性。
研究人员随后选取一份CPMMV阳性的甜瓜样本，通过五段重叠RT-PCR扩增产物的桑格测序（Sanger sequencing）以及5‘和3’末端快速扩增cDNA末端（RACE）PCR，获得了该病毒分离株的完整基因组序列。该基因组全长8194个核苷酸，已提交至GenBank（登录号PV448278）。分析显示，其复制酶蛋白（Rep protein）与来自苏丹的CPMMV分离株（QYA72502）的氨基酸序列一致性为93.1%，而外壳蛋白（Coat protein, CP）与来自巴西的分离株（QAU20933）的氨基酸序列一致性高达99.7%。
这项研究首次在全球范围内确认了甜瓜和黄瓜是豇豆轻斑驳病毒（CPMMV）的自然寄主。这一发现对葫芦科作物的病害防控具有重要的流行病学意义，因为它揭示了CPMMV存在向葫芦科作物进行跨物种传播的潜在风险。
主要技术方法概述
本研究的关键技术包括：1. 样本采集与处理：于2022年9月从巴西马托格罗索州商业田采集具症状的葫芦科植株，并按属分类制备混合样本池。2. 高通量测序（HTS）：从半纯化混合样本提取RNA，构建cDNA文库，使用Illumina Novaseq 6000平台进行测序，通过生物信息学分析初步鉴定病毒。3. RT-PCR验证：使用CPMMV特异性引物对混合样本池及个体样本进行靶向检测，确认病毒存在及寄主范围。4. 基因组测序：对阳性样本通过重叠RT-PCR和RACE PCR扩增，结合桑格测序获得病毒全长基因组。
研究结果
CPMMV在葫芦科作物中的初步检测与寄主范围确定
通过针对三个不同属的葫芦科植物混合样本池进行RT-PCR分析，发现豇豆轻斑驳病毒（CPMMV）仅在包含甜瓜和黄瓜的Cucumis属混合样本中被特异性检测到，初步明确了病毒在该属作物中的存在。
CPMMV阳性样本的田间发生频率与个体验证
田间调查显示，约5%的甜瓜植株和3%的黄瓜植株表现出疑似CPMMV感染的症状。对单独采集的18份个体样本（12份甜瓜，6份黄瓜）进行RT-PCR验证，确认其中3份甜瓜样本和1份黄瓜样本为CPMMV阳性，证实了该病毒在田间的自然发生。
CPMMV巴西分离株的基因组特征分析
从一份阳性甜瓜样本中获得了CPMMV的完整基因组序列（8194 nt）。序列比对表明，该分离株的复制酶蛋白（Rep）与苏丹分离株的同源性为93.1%，而外壳蛋白（CP）与另一巴西分离株的同源性高达99.7%，揭示了其地域相关的遗传特征。
研究结论与讨论
本研究通过系统的田间调查、分子检测和基因组测序，首次在全球范围内确证了甜瓜和黄瓜是豇豆轻斑驳病毒（CPMMV）的自然寄主。这一发现填补了CPMMV寄主范围知识的重要空白。研究所获CPMMV分离株的基因组序列为后续研究其遗传进化、致病机理以及与不同寄主互作提供了关键数据。更重要的是，该结果揭示了CPMMV在葫芦科重要经济作物间存在自然传播和定殖的潜力，构成了新的流行病学风险。考虑到白粉虱作为传播媒介的广泛存在，CPMMV对甜瓜和黄瓜产业的潜在威胁不容忽视。这项研究发表于《Journal of Plant Pathology》，其结论强调了加强针对CPMMV的田间监测、早期诊断以及制定相应防控策略的必要性，对于保障葫芦科作物安全生产具有重要的实践指导意义。
