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为解决传统蛋白生产方式资源消耗大、环境不友好，以及甲基化酵母在工业应用中面临耐受性有限、高成本灭菌需求等问题，本研究从新疆发酵骆驼奶中分离得到一株耐高浓度甲醇的库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）P22。该菌株耐受高达15% (v/v) 的甲醇及多种胁迫条件，并在5-L规模的开放、无灭菌补料分批发酵系统中，以7.5% (v/v) 甲醇为唯一碳源，实现了27.56 g/L的最大细胞干重（CDW），其中蛋白质含量高达54%。该工作鉴定了P22作为一种潜在的真核底盘细胞，用于开发甲基化酵母细胞工厂，并展示了一种简化操作、降低成本的规模化发酵新策略。
随着全球人口增长和资源日益紧张，传统的基于动物和植物的蛋白质生产模式面临着巨大挑战，包括巨大的土地、水和粮食消耗，以及严重的温室气体排放。在此背景下，单细胞蛋白（Single-Cell Protein, SCP）作为一种高效、可持续的替代蛋白源，正获得越来越多的关注。理想的SCP生产不仅需要微生物能高效转化各种原料，还需要其生产过程本身尽可能低成本、低能耗。甲醇，作为一种价格低廉、来源丰富的一碳（C1）化合物，是极具潜力的生物制造原料。然而，甲醇及其代谢中间体对大多数微生物具有细胞毒性，且工业上常用的甲基化模式酵母如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），其耐受性和生长在高浓度甲醇下仍受限。更重要的是，传统的生物发酵过程通常需要在严格无菌的封闭系统中进行，设备与原料的灭菌消耗大量能源，显著增加了生产成本。因此，寻找既能高效利用甲醇，又能在极端环境下生长、从而实现开放、无灭菌发酵的鲁棒性微生物底盘，对于推动可持续蛋白质生产的产业化至关重要。
为了探索这一可能性，研究人员从中国新疆阿勒泰地区的传统发酵骆驼奶中，筛选并鉴定了一株具有卓越耐受性的酵母新菌株。研究人员开展了一项系统性的研究，包括从样本中筛选耐受甲醇的酵母菌株，通过分子生物学和形态学方法对其进行鉴定，并全面评估其对甲醇、乙酸、氯化钠、极端pH和高温的耐受性。他们进一步分析了该菌株的蛋白质含量和氨基酸组成，并通过转录组学初步探索了其在甲醇环境下的代谢通路变化。研究的核心是验证该菌株在开放、无灭菌条件下，以甲醇为碳源进行规模发酵生产SCP的可行性。最终，该研究成果以“Robust Pichia kudriavzevii for open production of methylotrophic protein”为题，发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》期刊。
本研究主要应用了以下关键技术方法：从新疆发酵骆驼奶样本中采用稀释涂布和平板划线法分离纯化酵母；通过26S rDNA序列分析和系统发育树构建对目标菌株进行分子生物学鉴定；利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察细胞在不同碳源下的形态与超微结构；通过转录组测序（RNA-seq）和实时定量PCR（RT-qPCR）分析菌株在甲醇胁迫下的差异基因表达和代谢通路；在摇瓶和5升发酵罐中进行开放、无灭菌的补料分批发酵，以甲醇为唯一或主要碳源，监测菌体生长、细胞干重（CDW）和蛋白质产量。
研究结果
甲基化酵母的筛选：从发酵骆驼奶样本中初筛出134株酵母，其中15株能在以5% (v/v) 甲醇为唯一碳源的无机盐培养基上生长。进一步筛选出4株能在10%甲醇下生长的菌株，其中菌株3-1-20在液体培养中生物量积累最高，其生长性能优于常用的工业菌株P. pastorisGS115，因此被选为后续研究对象。
甲基化酵母的鉴定与形态结构观察：通过26S rDNA序列分析，菌株3-1-20被鉴定为库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），命名为P. kudriavzeviiP22。扫描电镜结果显示，在7.5%甲醇条件下，P22细胞呈明显的杆状，而在正常葡萄糖条件下为卵圆形。透射电镜观察发现，甲醇胁迫下细胞内部结构紧密聚集并出现大空腔，与正常条件下细胞成分均匀分布形成对比。
库德毕赤酵母P22耐受性的测定：耐受性测试表明，P22能在以15% (v/v) 甲醇为唯一碳源的培养基上生长，而P. pastorisGS115则不能，显示其卓越的甲醇耐受性。此外，P22可耐受5 g/L的乙酸和100 g/L的氯化钠，并在pH 2和47°C的条件下存活，展现出对酸、盐、高温的多重胁迫耐受性。
库德毕赤酵母P22蛋白质含量测定与氨基酸分析：通过凯氏定氮法测定，P22细胞的蛋白质含量高达54%。氨基酸分析共检出17种氨基酸，包括7种人体必需氨基酸。总氨基酸含量为494.799 mg/g，高于FAO/WHO的氨基酸评分标准。其中，谷氨酸含量最高，甲硫氨酸和胱氨酸含量相对较低。
库德毕赤酵母P22的转录组分析：比较以甲醇和葡萄糖为碳源培养的P22，转录组分析发现共有685个基因显著上调，606个基因显著下调。GO和KEGG富集分析表明，在甲醇条件下，与核糖体生物合成、RNA加工、氧化还原酶活性、氨基酸生物合成等相关的基因显著富集。值得注意的是，编码甲醇同化途径关键酶——二羟基丙酮合成酶（DAS）、二羟基丙酮激酶（DAK）和果糖-1,6-二磷酸酶（FBP）的基因表达上调，而编码乙醇氧化酶（AOX）的基因未检测到表达。基于此，研究初步推测P22可能通过一条不依赖AOX的木酮糖单磷酸途径（XuMP pathway）变体来代谢甲醇。
库德毕赤酵母P22通过开放无灭菌发酵工艺生产单细胞蛋白：碳源利用谱显示，P22能高效利用葡萄糖、果糖和甘油。其在28°C、pH 6的条件下生长最佳，并对低pH（pH 2）有高耐受性。在开放、无灭菌的摇瓶发酵中，P22能在含5%、7.5%和10%甲醇的培养基中生长且无杂菌污染。将发酵规模扩大至5升发酵罐，在一次性添加7.5%甲醇的开放发酵中，P22在44小时达到最大OD600（6.2）。在补料分批发酵中，当初始碳源耗尽后，通过补加甲醇维持发酵，P22可继续生长，在72小时达到最大OD60010.1，对应的最大细胞干重高达27.56 g/L。
研究结论与讨论：本研究成功从极端环境样本中分离出一株具有超高鲁棒性的库德毕赤酵母P22。其最突出的特性在于能耐受高达15%的甲醇，这是目前野生型酵母中报道的最高耐受浓度之一，并且对酸、热、高渗等多重胁迫环境具有出色的适应能力。这使其成为了一个极具潜力的、用于开放无灭菌发酵的真核微生物底盘。在5升规模的开放、无灭菌补料分批发酵中，P22以甲醇为主要碳源，成功生产出高蛋白质含量（54%）的生物质，验证了其用于低成本、可持续SCP生产的可行性。
这项研究的意义重大。首先，它为解决SCP生产中的两大核心成本问题——原料成本和灭菌能耗——提供了新思路：以廉价的甲醇为原料，并结合开放无灭菌的发酵工艺。其次，P22作为非模式、非基因工程改造的野生型酵母，且被美国FDA认定为安全，在法规和食品安全方面更具应用优势。此外，该工作初步解析了P22在甲醇胁迫下的代谢响应，为未来通过合成生物学手段进一步改造和优化该底盘提供了线索。当然，研究也指出了当前工作的局限，例如与高密度发酵菌株相比生物量产量仍有提升空间，以及作为非模式菌株其遗传工具和机理研究尚不完善。总之，P. kudriavzeviiP22的发现与应用展示，为构建基于C1原料的、经济环保的下一代蛋白质生产体系提供了一个有前景的实验室级平台，对推动全球蛋白质供应链的可持续性和韧性具有积极意义。
