编辑推荐：
本文报道了一种通过多步代谢工程改造毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞工厂，实现从廉价碳源高效合成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的创新策略。研究人员通过引入异源合成通路、优化前体供应和重塑碳源利用方式，最终使Neu5Ac产量提高了约111.5倍（达到1.03 g/L）。该研究为Neu5Ac的可持续生产提供了新路径，并为在毕赤酵母中表达唾液酸化乳铁蛋白等重要糖蛋白奠定了坚实基础。
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），作为最常见的唾液酸形式，在生物体内无处不在，扮演着细胞识别、信号转导和免疫调节等关键角色。它不仅能促进大脑发育、改善认知功能，甚至还有美白的潜力，因此在医药、食品和化妆品领域需求巨大。更妙的是，当Neu5Ac像精巧的糖链装饰一样连接到某些蛋白质（如乳铁蛋白）上时，这个过程被称为唾液酸化，它能显著增强这些蛋白的生理活性，比如延长它们在体内的半衰期，或者增强其抗病毒能力。然而，传统的Neu5Ac生产方式，无论是从天然产物中提取、化学合成还是全细胞生物催化，都面临着成本高昂、效率低下或环境负担重等问题，难以满足大规模、可持续的工业化生产需求。与此同时，虽然大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等工程菌株已被用于高效生产Neu5Ac，但它们自身存在局限——大肠杆菌有潜在的内毒素风险，增加了下游纯化的复杂度和成本；而其他一些菌株的产量仍有待提升。因此，开发一种安全、高效的微生物“细胞工厂”来生产Neu5Ac，尤其是用于表达唾液酸化的活性蛋白（如乳铁蛋白），就成为了一个亟待突破的科学前沿。
在这一背景下，毕赤酵母（Pichia pastoris，现学名Komagataella phaffii）因其“公认安全”（GRAS）的特性、快速的生长速度、高密度培养能力以及对重组蛋白的优秀表达能力，成为了一个极具吸引力的候选宿主。它早已是生产重组蛋白的明星平台，但将其改造为高效合成Neu5Ac的工厂，此前未见报道。本研究的目标，正是要系统地改造毕赤酵母的代谢网络，为其装上生产Neu5Ac的“生产线”，并优化“原料”供应，最终实现Neu5Ac的高效生物合成。这项研究成果最终发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》期刊上。
为了达成这一目标，研究人员综合运用了多项关键分子生物学与代谢工程技术。他们以毕赤酵母GS115菌株为出发底盘，首先删除了ku70基因以促进后续的同源重组效率。研究团队通过一系列基因敲除、启动子替换（如使用强启动子PGAP进行过表达，使用甘油诱导型启动子PGUT1进行弱化表达）和基因整合操作，系统性地改造了宿主的代谢通路。这些操作包括引入来自酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、大肠杆菌等不同来源的Neu5Ac合成关键基因，对中心碳代谢关键节点（如pfk1、zwf、pfk2、pyk）进行调控以增加前体供应，以及重构甘油代谢途径（过表达gt2、gut1、gut2）以实现葡萄糖-甘油协同利用。改造过程中产生的多个工程菌株（从N0到N6）均在摇瓶中进行发酵培养，并采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）等高通量分析技术，对发酵液中的Neu5Ac、其前体N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）以及底物葡萄糖、甘油进行了精准定量分析。
研究团队取得了一系列循序渐进的成果。首先，在“构建Neu5Ac生产菌株”阶段，他们成功将异源Neu5Ac合成途径引入到经过pfk1、zwf弱化和pfk2敲除以积累前体果糖-6-磷酸（F6P）的毕赤酵母N1菌株中，构建出菌株N2。质谱分析明确证实，N2菌株具备了合成Neu5Ac的能力，产量为9.19 mg/L，而出发菌株N0和改造菌株N1均未检测到Neu5Ac。这标志着Neu5Ac生物合成路径在毕赤酵母中的成功建立。
其次，在“通过增强前体供应提高Neu5Ac产量”方面，研究者聚焦于两个关键前体：磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和谷氨酰胺。他们通过弱化编码丙酮酸激酶的pyk基因表达，减少PEP的消耗，使Neu5Ac产量提升至19.43 mg/L（菌株N3）。随后，通过过表达编码谷氨酰胺合成酶的gs基因，增加谷氨酰胺供给，进一步将Neu5Ac产量推高至34.82 mg/L（菌株N4）。这些结果表明，提高前体供应是提升Neu5Ac产量的有效策略。
接着，研究探索了“葡萄糖和甘油协同利用对Neu5Ac生产的积极影响”。为了解决葡萄糖代谢改造后细胞生长减缓的问题，并利用甘油代谢补充PEP，他们对甘油利用通路进行了工程化改造（过表达gt2、gut1、gut2），解除了葡萄糖对甘油利用的碳代谢抑制，构建出能同时利用葡萄糖和甘油的菌株N5。发酵结果显示，N5菌株实现了葡萄糖和甘油的同步消耗，Neu5Ac产量大幅跃升至285.41 mg/L，较N4提高了8.20倍。这证明了甘油代谢能有效补充PEP，是Neu5Ac合成的限速步骤。
最后，为了“通过增加关键基因拷贝数来改善Neu5Ac合成”，研究者在N5基础上，额外整合了一个拷贝的关键合成基因（gfa1、age、neuB），并在强启动子PGAP下表达，构建了菌株N6。这一策略取得了显著成效，使Neu5Ac产量达到了1.03 g/L，相比N5提高了2.59倍，相较于最初的N2菌株实现了约111.5倍的飞跃。同时，前体GlcNAc也积累到3.21 g/L，提示下游酶促步骤可能存在新的代谢瓶颈。
综上所述，本研究通过一系列精密的代谢工程策略，成功将毕赤酵母改造为能够高效合成Neu5Ac的细胞工厂。研究结论与讨论部分强调了这项工作的重要意义：它不仅为Neu5Ac的可持续、低成本生物制造提供了一条新途径，更重要的是，为在毕赤酵母这一安全宿主中直接生产唾液酸化的活性糖蛋白（如乳铁蛋白）奠定了关键的代谢基础。尽管目前1.03 g/L的产量在摇瓶水平上仍低于部分大肠杆菌或枯草芽孢杆菌体系，但这在非优化、小规模的条件下已是一个强有力的概念验证。研究指出，未来的优化方向包括：精细调控各关键酶（如Gfa1、Age、NeuB）的表达比例以提高GlcNAc到Neu5Ac的转化效率；通过酶工程技术提升关键酶的催化活性；解决代谢改造导致的ATP生成不足问题；以及在生物反应器中进行高细胞密度补料分批发酵，以期实现产量的进一步突破。这项研究展示的多策略代谢工程框架（异源通路引入、前体供应增强、共底物利用）具有高度的可移植性，为利用毕赤酵母合成Neu5Ac及其他高附加值化合物提供了宝贵的范例，推动了合成生物学和生物制造领域的发展。
