《BIOspektrum》：Zellfreie Proteinsynthese zum effizienten Screening von Biokatalysatoren
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传统生物催化剂（酶）的发现与改造常受限于活细胞表达系统的低通量与复杂性。为解决这一瓶颈，研究者专注于“无细胞蛋白质合成（CFPS）”技术平台开发。研究表明，该体系成功实现了多种氧化还原酶的高效表达与直接筛选，展现出较传统体内方法更高的效率与灵活性。此项工作为快速发掘与优化工业级生物催化剂提供了强有力的体外工具。
在生命科学的工具箱里，制造蛋白质——这些执行几乎一切生命功能的分子机器——一直是核心任务。传统上，这项工作交由活细胞来完成，就像利用一个微型的、功能齐全的工厂。科学家将编码目标蛋白质的基因（DNA）送入细胞（如大肠杆菌），细胞自身的复杂机制便会读取指令，合成出我们想要的蛋白质。这种方法，即体内表达，是生命科学研究的基石，为我们提供了研究蛋白质结构与功能的宝贵材料。然而，当任务转向大规模、高效率的筛选与优化生物催化剂——尤其是那些在工业生产中极具价值的酶——时，这座“微型工厂”的局限性便凸显出来。细胞膜的存在成为物质进出的屏障，复杂的细胞代谢网络可能干扰目标蛋白的生产，培养细胞耗时耗力，且难以实现真正的高通量平行操作。更关键的是，有些对细胞本身有毒性的蛋白质或需要特殊辅因子的酶，在活细胞内根本无法有效生产或正确折叠。那么，能否抛开完整的细胞，只保留其中最核心的合成机器，在一个更简单、更可控的试管环境中直接制造蛋白质呢？这正是“无细胞蛋白质合成（Cell-Free Protein Synthesis， CFPS）”技术所追求的愿景。它旨在将细胞裂解，提取出包含核糖体、酶、tRNA和能量物质的细胞质组分，构建一个精简的“体外合成车间”。这项研究正是为了探索如何将CFPS这一平台，高效地应用于生物催化剂（主要是氧化还原酶）的快速发掘与性能评估，以应对传统方法在通量、速度和适用性上的挑战。
为了开展这项研究，研究人员主要依托无细胞蛋白质合成（CFPS）技术体系。该体系的核心是从特定细胞（研究中未明确说明具体来源细胞系）中提取并制备出包含所有必要翻译组分的裂解物。在此基础上，通过优化反应条件（如镁离子、钾离子浓度、能量再生系统等），并直接加入编码目标酶的线性DNA模板或质粒DNA，驱动目标蛋白质在体外高效表达。表达出的酶无需复杂的破碎和纯化步骤，可直接在原反应液或经过简单处理后，用于后续的酶活测定与筛选。研究中对多种氧化还原酶进行了表达测试，并通过光谱法或生色底物法对其催化活性进行了定量分析，以评估CFPS平台用于酶筛选的可行性与效率。
研究成果
1. CFPS体系可实现多种氧化还原酶的功能性表达
研究首先证明了所建立的CFPS平台能够成功合成多种不同家族的氧化还原酶，包括脱氢酶、加氧酶等。通过活性测定确认，这些在体外合成的酶大多具有正确的折叠构象和催化功能，其活性与通过传统体内表达并纯化得到的酶相当，甚至在某些情况下更优。这表明CFPS体系能够提供适合这些酶正确折叠和辅因子（如NAD(P)H、FAD）整合的微环境。
2. CFPS体系适用于高通量筛选
由于CFPS反应体积可以很小（微升级），且无需细胞培养步骤，使得在96孔板或384孔板中平行进行数百个甚至上千个蛋白质合成与活性测试成为可能。研究展示了如何利用这一特性，快速筛选不同突变体库或不同基因来源的氧化还原酶活性。与需要单克隆培养、诱导表达、细胞破碎的体内方法相比，CFPS将筛选周期从数天缩短至数小时，极大提升了筛选通量。
3. CFPS体系对“难以表达”的酶具有优势
对于一些在活细胞内表达水平低、易形成包涵体或对宿主细胞有毒性的酶，CFPS体系显示出独特优势。因为体外体系不存在细胞存活压力，可以通过调整反应条件（如添加分子伴侣、调整氧化还原电位）来促进这类“困难”蛋白的可溶性表达与功能复活。研究通过实例表明，某些在体内无法获得可溶活性形式的酶，在CFPS体系中却能成功获得有活性的产物。
4. CFPS体系便于整合人工合成组件
CFPS的开放性允许研究人员灵活地向反应体系中添加非天然组分。例如，可以引入人工合成的辅因子类似物、非天然氨基酸或定制化的能量再生系统，从而直接生成并筛选具有新颖化学性质的工程酶。研究探讨了这种灵活性在创造新型生物催化剂方面的潜力。
结论与讨论
本研究系统性地论证了无细胞蛋白质合成（CFPS）作为一个高效、灵活平台，在生物催化剂筛选与应用开发中的巨大价值。其主要结论在于：CFPS技术能够克服传统体内表达系统的多种局限，实现氧化还原酶等生物催化剂的高效、功能性表达；其模块化、开放性的特点特别适合于高通量筛选、困难蛋白表达以及集成人工合成生物学元件，从而极大地加速了酶发现与蛋白质工程的进程。
讨论部分进一步强调了这项工作的意义。首先，它为工业生物技术和合成生物学领域提供了一个强大的上游工具。通过CFPS进行快速原型构建与初筛，可以大幅降低后续体内工程化改造的盲目性与时间成本，形成“体外快速筛选-体内精细优化”的高效研发闭环。其次，这项研究展示了基础生物化学工具（CFPS）解决实际应用问题（催化剂筛选）的能力，体现了学科交叉的推动力。将CFPS与自动化液体处理工作站、微流控芯片及在线分析检测技术结合，有望构建全自动的“设计-构建-测试-学习”循环，真正实现生物催化剂的理性设计与定向进化。最后，作者也指出了当前CFPS体系在成本、长期稳定性以及某些复杂多亚基酶表达方面仍面临的挑战，未来的研究将集中于优化裂解物制备工艺、开发更廉价的能量再生系统以及拓展其适用于更广泛酶类的通用性。这项工作发表在《BIOspektrum》上，为领域内研究人员提供了切实可行的方案与前瞻性的视角，推动无细胞合成系统向着更实用、更强大的应用平台发展。
