《Frontiers in Catalysis》：The phosphorylated tyrosine as a gatekeeper for topoisomerase catalytic activity: a molecular dynamics simulation study
编辑推荐：
这篇综述通过分子动力学模拟，揭示了DNA拓扑异构酶IA（dTopo-IA）催化过程中的关键机制。研究发现，活性位点酪氨酸与DNA骨架共价连接形成的磷酸化酪氨酸（PTR）中间体，如同一个“守门员”，精确调控着DNA“闸门”的开启与关闭，从而允许T-链（transport-strand）穿过，实现DNA超螺旋的松弛。研究深入探讨了Gln-223、Arg-533和Lys-117等关键残基的酶学作用，并系统分析了RMSD、RMSF、MM/GBSA结合自由能等关键参数，为理解该酶的催化机制提供了原子层面的新见解，并为靶向该过程开发抗癌疗法（如干扰癌细胞DNA复制）奠定了理论基础。
文章内容总结
1 引言
DNA拓扑异构酶（dTopoE）是在DNA复制、转录、染色体分离和重组等细胞生长过程中起关键作用的细胞酶。它们能够改变DNA的拓扑状态，是其核心功能的基础。DNA拓扑异构酶IA（dTopo-IA）是其中一类，它结合单链DNA，由I至IV等多个结构域组成。其催化机制涉及活性位点酪氨酸（Tyr）与DNA的5′-磷酸基团形成共价的磷酸化酪氨酸（PTR）中间体，从而引入瞬时的单链断裂。断裂的DNA链称为“闸门链”（G-strand），允许另一条称为“转运链”（T-segment）的未切割DNA链穿过。这一链传递过程伴随着DNA“闸门”的构象变化，从而改变DNA的链接数，实现DNA松弛。尽管dTopo-IA被认为通过酶诱导的DNA闸门介导链传递，但该闸门的实际开启过程尚未在实验或理论上得到证实。本研究旨在阐明在双链DNA（dsDNA）存在下，中间复合物形成后闸门开启的分子机制。
2 计算细节
为计算研究DNA dTopo-IA酶，本研究采用了三步计算方案。
2.1 系统搭建
为探索在dsDNA存在下中间键形成时闸门开启机制如何发生，从蛋白质数据库（PDB）获取了dTopo-IA和dTopo-I的实验坐标（PDB ID: 1MW8和3PX7）。使用Chimera MODELLER程序对蛋白质部分的缺失残基进行建模，并选择最佳评分模型用于后续模拟。DNA序列使用UCSF Chimera工具转换为双链DNA。为将dTopo-IA中的活性位点酪氨酸转化为磷酸化酪氨酸（PTR），使用Gaussian 09软件包在B3LYP/6-31++G (2d, 2p)理论水平下，采用密度泛函理论（DFT）方法生成了该残基的必要参数。在双链DNA中进行人工切割，将一条DNA链断裂并将相应核苷酸修饰为胸腺嘧啶（MDT5）。使用xleap键命令在PTR残基和DNA核苷酸之间建立键。然后，将带有共价中间体的dTopo-IA复合物和不带共价键的dTopo-I进行比较，以研究有无中间共价键时酶的作用差异。
整个修饰后的复合物分子被输入到AMBER18软件包的xleap程序中。蛋白质使用ff14SB力场处理，DNA使用DNA.OL15力场处理。对于共价键磷酸化酪氨酸，使用了广义AMBER力场（GAFF2）的leaprc.phosaa10。使用B3LYP/6-31++G (2d, 2p)理论水平下的RESP电荷拟合方法，获得了PTR的原子部分电荷和缺失参数。
为中和蛋白质-DNA复合物，根据其电荷添加了Na+离子（dTopo-I添加14个，dTopo-IA添加19个）。整个系统被溶剂化在TIP3P水模型的立方盒子中，从蛋白质边界向外延伸最小截断距离为12.0 ?。
2.2 分子动力学（MD）模拟设置
在生成所需的坐标和拓扑文件后，分两部分进行最小化，共10,000步，使用最陡下降法（5,000步）和共轭梯度法（5,000步）。第一步，复合物分子被限制在500 kcal/mol·?2的权重下，而水和中和离子是自由的。第二步，整个系统在没有约束的情况下进行最小化。
系统在NVT系综下在50 ps内逐渐加热至300 K。随后，在NPT系综下进行1 ns的密度平衡，保持300 K温度和1 atm压力，使用朗之万恒温器和贝伦森恒压器调节。接着，在进行200 ns分子动力学（MD）生产运行之前，进行了3 ns的无约束平衡阶段。生产运行对所有复合物系统使用了蒙特卡洛恒压器。使用粒子网格埃瓦尔德（PME）方法处理长程静电相互作用，截断距离为10 ?，并使用SHAKE算法约束涉及氢原子的键。所有MD模拟均使用AMBER18软件包执行。
所有MD模拟均使用AMBER18的CPU版本进行。每个系统生成了三个独立的200 ns重复模拟，并在模拟时间尺度内观察到关键结构和动力学指标（RMSD、RMSF、氢键和PCA）的收敛。
2.3 轨迹分析
使用AMBER Tools中可用的CPPTRAJ模块进行轨迹分析。分析包括计算各种基本参数，如均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、氢键数量（Hbond）、氢键距离变化、回转半径（RoG）和溶剂可及表面积（SASA）。为可视化和渲染图形，使用了VMD和PyMOL。利用VMD的可视化能力研究系统的氢键动力学及其结构特性。这需要使用严格的标准计算极性键的形成和占据率，例如供体-受体距离小于3.0 ?，角度截断为20°。此外，通过检查每残基分解自由能，探索了系统的分子结构，从而更深入地了解正在发生的构象转变和结构转变。
3 结果与讨论
3.1 分子稳定性与动态行为
完成200 ns分子动力学（MD）模拟后，使用几个关键参数对蛋白质-DNA复合物的结构稳定性和动态柔性进行了深入评估。对残基1至621（包括DNA链）的RMSD进行了细致监测，揭示了系统构象稳定性的宝贵见解。此外，使用AMBER包的CPPTRAJ模块计算了RMSF、RoG和SASA，对整个模拟过程中系统的稳定性和灵活性进行了全面分析。
从酶残基和dsDNA残基的RMSD计算中，我们发现所有系统在最初的20-30 ns表现出初始平衡阶段，随后在模拟的剩余时间内呈现出明显的稳定期。
对于dTopo-IA复合物，酶主链RMSD（黑线）在平衡过程中逐渐增加，并稳定在约3.5-4.0 ?，表明酶的整体折叠在200 ns的轨迹中保持稳定。相应的DNA RMSD（红线）保持在较低水平，在2.0至2.8 ?之间波动，表明DNA双链仅经历了中等的构象调整，同时保持了结构完整性。30 ns后，复合物分子的RMSD稳定下来，表明在PTR中间键形成后，DNA链和拓扑异构酶分子调整到了稳定的取向，最小偏差约为3.2 ?，而对于无切割的系统，该偏差约为4.5 ?。对DNA RMSD的详细检查表明，其变化主要归因于双链DNA碱基的贡献。具有共价复合物的系统的RMSD在约3.2 ?处振荡。相比之下，DNA碱基显示出相对较高的RMSD（接近3.0 ?），表明晶体研究中观察到的偏差与我们的发现一致。
根据RMSD分析，两种酶系统总体上获得了稳定的构象；然而，dTopo-IA复合物对蛋白质和DNA都显示出显著更低的RMSD值，这与PTR形成后稳定性增强一致。非切割（dTopo-I）系统更高的RMSD表明DNA-酶界面刚性较低，更灵活。
为确保轨迹的稳定性和可重复性，对每个系统进行了三次独立的MD模拟，并绘制了相应的RMSD图。图3描绘了一个具有早期收敛性的代表性MD重复，以说明构象行为。
两种复合物的RMSF与残基编号的关系如图4A所示。不同结构域中波动最高的残基范围来自结构域D-I（27-126）、D-II（205-305）和D-III（306-500），而D-IV（501-621）保持稳定。
在dTopo-IA的DNA残基（1-26）中发现了最高的波动。这表明在闸门开启期间，当活性结构域III（306-430）允许DNA T-链通过时，这些残基受到排斥，从而产生此类波动。这种现象源于复合物dTopo-IA内结构域I（残基27-179）的动态运动。当结构域II和III对齐时，结构域I表现出约4.5 ?的向下位移，随后是约5.5 ?的向后移位。这种运动与相关研究中的结构观察结果密切相关。然而，本研究方案阐明了关键残基如Pro-255、Ser-256、Ala-259和Glu-296的具体构象，这些残基可能有助于这种结构域流动性。这些残基的构象相互作用如图4D, E所示。
图5A提供了关于模拟期间形成氢键数量的信息。图5B描绘了供体-受体距离随模拟时间的变化。最初，PTR-345的O3P与Arg-347的NH2基团之间的距离延伸至8.5 ?，涉及PTR-345的OH与Arg-347的NH2的距离接近8.0 ?。10 ns后，当酶-dsDNA复合物变得稳定且闸门关闭时，PTR-345和Arg-347靠得更近，它们的相互作用距离稳定在3.7 ?，形成弱的供体-受体相互作用。同时，PTR-345的氧与Thr-348的氮之间的弱氢键稳定在约2.6 ?。随着PTR-345的OH与Arg-347的NH2之间的氢键收缩至2.5 ?，发生了显著的变化。在整个模拟过程中，PTR-345中的氧与Thr-348中的氮之间的弱氢键稳定保持在2.8 ?。然而，170 ns后，PTR-345的O3P与Arg-347的NH2之间的供体-受体距离重新稳定在4.5 ?，超过了典型的氢键截断；这应被解释为供体-受体接触，而非氢键。PTR-345与其他分子的分子相互作用如图5C所示。
在我们的涉及dTopo-IA的蛋白质-DNA复合物的MD模拟中，回转半径（RoG）是理解构象动力学的关键指标。RoG随模拟时间变化的图展示了有趣的动力学。RoG表现出显著波动，对于不含PTR残基的复合物，最高达到34.0 ?，而对于具有共价键PTR残基的系统，RoG值为31.5 ?。50 ns后，在dTopo-I的平均值（32.3±5.1）?和dTopo-IA的平均值（61.9±11.3）?处，两个复合物都变得稳定。这种变异性归因于沿旋转轴排列的非氢原子的集体相互作用。此后，RoG稳定下来，表明系统在施加的条件下弛豫。这些观察结果强调了在模拟环境中控制构象动力学的分子力的复杂相互作用，为蛋白质-DNA复合物的稳定性和行为提供了有价值的见解。
溶剂可及表面积（SASA）衡量酶结构对溶剂分子可及的表面积。该指标提供了对构象变化和蛋白质-DNA相互作用的见解。图6B展示了两种复合物的SASA随模拟时间的变化。这里，复合物的平均值首先是（365.8±23.5）nm2，而另一个是（304.7±17.3）nm2。可及面积的稳定表明复合物发生了构象调整，这可能为DNA再连接创造了更有利的环境，如图6C所示，这是在轨迹分析期间拍摄的快照。然而，SASA本身并不驱动这一过程。
3.2 MM/GBSA与分解能计算
MM/GBSA计算提供了受体配体（DNA）的结合自由能。受体DNA之间高度负值的结合自由能表明了更强的相互作用。这里我们计算了两个不同模拟系统最后200帧（175 ns后）的广义玻恩模型（igb = 5）结合自由能分子。在第一个没有中间键的模拟系统中，结合自由能的值为-442.1 kcal/mol。此外，在dsDNA与dTopo-IA酶的情况下，结合自由能为-108.6 kcal/mol。这种具有共价中间键的复合物结合能（B.E）的损失表明，在中间键形成后，dsDNA的T-链变得不稳定，因此由于这种高能量，发生了T-链的链传递。
分子力学能量函数是一个成对相加的函数，可以分解为每残基组分。每残基结合能分解分析揭示了各种氨基酸对总结合能的贡献。从分解分析中，提取了一致相互作用的氨基酸的贡献，并推导了它们与实验活性的相关性。Arg-519、Gln-223、Arg-533、Ala-216、Lys-212、Arg-90、Thr-65、Arg-96、Val-201、Gly-202、PTR-345、Lys-41和Lys-117显示的能量贡献（以kcal/mol计）分别为-15.9、-17.2、-5.7、-5.9、-5.6、-7.8、-13.5、-11.3、-11.1、-6.8、-24.0、-6.5和-5.1。Arg-519、Gln-223、Arg-533、Lys-212、Val-201和Gly-202的能量提供了有利的相互作用，表明它们的能量贡献与稳定酶-DNA相互作用相关，促进了闸门开启和DNA螺旋T-链的通过。在氨基酸中，Gln-223、Arg-533、Val-201和Lys-212与DNA链相互作用以开启闸门。dTopo-IA酶氨基酸与DNA的相互作用能量图如图7所示。剩余的MM/GBSA用于计算相互作用图，这非常有帮助，因为它识别了非极性和疏水性相互作用。无法以与盐桥和氢键相同的方式检查这些相互作用。在氨基酸中，Gln-223、Arg-533、Val-201和Lys-212与DNA链相互作用以开启闸门。
DNA链通过疏水性相互作用在水性环境中与Val-201、Glu-223和Arg-533发生有利的相互作用，但同时PTR-345是共价键合的。这些非极性和疏水性残基对酶残基与DNA相互作用残基相互作用期间发生的整个焓的正向变化产生了重大影响。
为找出系统的全局运动，对dTopo-I和dTopo-IA的MD轨迹进行了主成分分析（PCA）。沿前两个主成分（PC1和PC2）的投影结果显示，共价中间体复合物（dTopo-IA）表现出更广泛的构象采样，表明与非共价dTopo-I系统相比，其结构灵活性增强。
4 氢键的润滑作用
在PTR残基与DNA之间形成中间共价键后，闸门打开，允许DNA的T-链残基与活性结构域PTR-345、Arg-347和Met-346附近可用的水分子之间发生相互作用。T-链残基DA-5、DA-6和DG-7与水分子之间相互作用距离的变化如图10A所示。值得注意的是，活性位点内水分子的存在通过充当分子“润滑剂”促进了这些相互作用。这些水分子有助于稳定瞬态的氢键网络，从而协助T-链穿过酶。当T-链穿过闸门时，水分子从活性结构域动态地移除以容纳DNA链。尽管直接实验观察此过程具有挑战性，但分子动力学模拟表明这种机制是可行的。氢键与水分子之间的这种动态相互作用提供了对水在DNA拓扑异构酶功能中润滑作用的见解。该区域瞬时水通道的形成如图10B所示。
5 G-链开启与T-链通过
为深入研究dTopo-IA在闸门开启和关闭过程中的构象稳定性，我们监测了模拟期间的分子间距离。在存在共价中间键复合物的情况下，PTR-345–DT21和PTR-345–DT22之间的距离在100 ns后显著增加，DT21–DT22的分离从8.0 ?扩展到18.0 ?——表明闸门完全打开。此外，非共价状态显示了Tyr-318–DG9和Arg-364–DG9的距离，表明闸门开启前的灵活性。与DA5、DA6和DG7的水介导相互作用在约50 ns时稳定下来，支持了它们在维持开放闸门构象中的作用。这些研究揭示了一个涉及共价键形成和水介导稳定的闸门激活顺序机制。
6 结论
我们的计算和分子动力学模拟研究提供了磷酸化酪氨酸（PTR）在调节DNA拓扑异构酶IA（dTopo-IA）闸门开启动力学中的核心机制作用。我们200 ns的分子动力学模拟，得到关键结构和能量分析的支持，表明PTR与DNA之间共价键的形成对于实现T-链通过和随后的酶构象转变至关重要。来自结构稳定性、氢键性质和能量分解的综合见解共同表明了一个由PTR及其相互作用伙伴驱动的协调机制。值得注意的是，发现诸如Gln-223、Arg-519和Lys-117等残基对复合物稳定性和催化功能有显著贡献。这项研究为未来的研究奠定了重要基础，这些研究专注于设计靶向癌症抑制剂，以破坏PTR介导的闸门开启，从而可能阻止增殖性癌细胞中的拓扑异构酶活性。它也可能推动对引起耐药性的突变、与其他拓扑异构酶亚型的比较研究以及用于治疗或合成生物学应用的拓扑异构酶变体工程的探索。总之，这项研究不仅解读了拓扑异构酶功能的结构基础，而且为药物开发和分子设计开辟了转化机会。
