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本研究系统揭示了工业大麻中非精神活性大麻素CBC积累的显著遗传变异，并证实高CBC表型可稳定遗传且受环境影响较小。作者通过分析多个III型（CBD优势）品种，首次报道了品种内存在CBC高产亚群，这一新化学亚型（sub-chemotype）的发现对于培育高CBC、低THC（<0.3%）的大麻品种以用于医疗和工业领域具有重要意义。
引言（INTRODUCTION）
大麻（Cannabis sativa L.）以其复杂多样的化学成分而闻名，其中大麻素类化合物因其与人内源性大麻素系统的相互作用而具有广泛的药理效应。除已被广泛研究的Δ9-四氢大麻酚（THC，精神活性成分）和大麻二酚（CBD）外，大麻色酚（CBC）等次要大麻素因其在临床前研究中展现出的抗炎、镇痛、抗菌和抗抑郁等特性，正受到越来越多的关注。所有大麻素均由共同前体——大麻萜酚酸（CBGA）通过特定合成酶的催化作用合成。其中，大麻色酚酸（CBCA）由大麻色酚酸合成酶（CBCAS）催化生成。尽管大麻素分类学通常将大麻品种分为I型（THC优势）、II型（THC/CBD混合）和III型（CBD优势），但越来越多的证据表明，品种内存在显著的表型变异。本研究旨在系统探究III型大麻品种中CBC积累的品种内变异，以揭示影响其生产的遗传和环境因素。
材料与方法（MATERIALS AND METHODS）
研究使用了多种III型大麻品种，如HBA-2、Cherry Wine、River Rock、BaOX等，这些材料来自不同的商业和研究种植环境，包括美国科罗拉多州、加利福尼亚州、威斯康星州、北卡罗来纳州和弗吉尼亚州的室内可控环境和户外田间试验地，覆盖了从第5a到第10b的多种耐寒区，以评估真实世界条件下的表现。植物样品在开花期间按周采集，或在成熟期依据美国农业部（USDA）大麻采样协议采集顶部花序。样品经干燥、研磨后，使用高效液相色谱法（HPLC）定量分析大麻素含量，包括CBC、CBCA、CBD、CBDA、THC和THCA等，数据通过混合线性模型和三维散点图进行分析。同时，研究采用单核苷酸多态性（SNP）芯片基因分型和高分辨率熔解曲线（HRM）分析技术，对关键大麻素合成酶基因（如CBDAS、THCAS、CBCAS和橄榄醇酸合成酶[OLS]）的遗传多样性进行了评估。
结果（RESULTS）
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大麻品种种质资源的线性关系化学型分析
对四个III型大麻种质（T1-#5、River Rock、HBA2和Cherry Wine）的分析显示，总THC和总CBD含量之间存在稳健的线性正相关关系，表明这两种主要大麻素的积累呈比例协调。然而，将CBC纳入分析后，情况变得复杂。三维散点图分析揭示，在HBA和Cherry Wine两个种质中，存在CBC水平显著偏离THC-CBD线性关系的亚种群。这些亚种群代表了一种新的化学亚型，其特征是在整个生长周期和最终收获期均表现出显著升高的CBC积累。相比之下，River Rock和T1-#5种质内的个体则表现出持续较低的CBC水平。
为了探究高CBC化学亚型的稳定性，研究分析了Cherry Wine种质在多个近交世代（F1和F2）和不同地理位置的表型。结果发现，其高CBC表型在不同世代和不同地点均表现出惊人的一致性，表明该性状稳定且由遗传决定。相反，River Rock种质在相同条件下始终表现出低CBC水平。这一对比证实，高CBC生产是一种化学型特异性状，很可能由不同的遗传等位基因控制。在分析具有可测量丙基侧链大麻素（如大麻色酚变素[CBCV]）的III型品种时，也观察到了类似的化学亚型分布模式。
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不同品种CBC积累的时空动态
对开花周期内总CBC水平的时序分析表明，从开花后21天开始，两个受试品种（RR-11-S1和T1-#5-S1）的CBC积累均出现统计学上的显著增加，并在第42天达到峰值，该峰值在发育后期得以维持。此外，研究还揭示了花组织和叶组织中CBC积累模式的差异：在花组织中，CBC百分比持续增加；而在叶组织中，CBC水平则较早达到峰值随后下降。这表明CBC在花和叶组织中的调控和/或生物合成存在差异。
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大麻种质资源的遗传分化
基于全基因组SNP标记的基因型分析将四个大麻种质（Cherry Wine、T1-#5、HBA2和River Rock）清晰地分为不同的遗传群组。Cherry Wine种质表现出比预期更大的遗传异质性，形成了两个不同的遗传簇，这可能与其高CBC性状的复杂遗传机制有关。而T1-#5和River Rock种质则表现出更高的遗传同质性。对第7号染色体上一个特定SNP标记的分析证实，所有四个种质都携带与CBD相关的单倍型，与其III型分类一致。HRM分析进一步揭示了关键大麻素生物合成基因的遗传变异模式。例如，在Cherry Wine种质中，CBDAS和CBCAS均显示出多样化的熔解曲线谱，对应不同的基因型；而所有种质均未检测到THCAS。特别值得注意的是，Cherry Wine个体在CBCAS标记上表现出三种不同的熔解曲线谱，这与SNP分析观察到的遗传异质性相一致，并提示不同的CBCAS等位基因可能导致了该品种内CBC产量的变异。
讨论（DISCUSSION）
2018年美国农业法案将总THC含量不超过干重0.3%的大麻定义为合法工业大麻，这给种植者带来了控制THC水平的持续压力。CBC与CBD共享同一前体CBGA，这一特性为种植者提供了一个潜在策略：通过操纵代谢过程使CBGA流向CBCA合成，从而减少其向THCA的转化，这有助于在维持THC合规的同时，开发CBC的潜在治疗价值。
本研究在大麻中观察到的CBC积累品种内变异，以及品种内存在具有不同CBC生产水平的明显化学亚型群体，突显了大麻素生物合成背后的遗传复杂性。尽管所有III型种质中总THC和总CBD含量存在强线性相关性，但CBC的引入揭示了一种新的化学亚型。Cherry Wine种质高CBC表型在不同世代和环境中的稳定性，强烈支持该性状具有遗传基础，并与关键酶编码基因（尤其是与CBCAS相关的基因）的等位基因变异影响大麻素谱的观点相符。
CBC积累的时序动态证实了大麻次生代谢物生产的动态性质。花与叶组织积累模式的差异可能源于组织特异性调控、酶的亚细胞定位、底物可用性或转运机制等因素。
SNP和HRM分析揭示的种质内和种质间显著的遗传多样性，为观察到的化学型变异提供了遗传学解释。Cherry Wine种质在保持高CBC表型的同时表现出较高的遗传异质性，提示可能存在不同的遗传机制共同导致这一性状。
本研究也存在一定局限，例如分析的种质数量相对于大麻物种的广泛遗传多样性而言有限，且环境因素（如光照强度、养分有效性）在受控条件下的系统研究有待深入。未来研究应扩大遗传采样范围，并深入探索控制CBC生产的具体遗传因素和分子机制。
结论（CONCLUSION）
本研究为CBC生产受遗传控制提供了有力证据。通过识别不同的化学亚型群体，并证明高CBC表型在不同世代和环境中具有一致性，支持了特定遗传位点或等位基因负责该性状的假说。CBC积累的时空变异则突显了大麻素生物合成调控的复杂性。这些发现为通过选择性育种开发CBC富集品种、优化其医疗和工业应用生产奠定了重要基础。未来的研究应聚焦于确定控制CBC生产的具体遗传因素和分子机制。
