《Bioengineering & Translational Medicine》：Tissue-specific gene delivery approaches
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这篇综述系统性地梳理了实现系统性给药后组织特异性基因递送的关键策略与挑战。文章聚焦于腺相关病毒（AAV）、脂质纳米颗粒（LNP）和聚合物纳米颗粒（PNP）三类主流递送平台，深入探讨了如何通过被动、内源和主动靶向机制，克服血液、肝脏、脾脏、肺、淋巴管、大脑及其他难以触及器官的生理屏障，以实现高效的靶器官富集和基因转导。同时，综述还总结了各平台的设计、工程化及高通量筛选方法，旨在为开发兼具高效性与安全性的下一代组织特异性基因疗法提供路线图。
2 器官特异性屏障
系统给药的基因载体需穿越一系列生理屏障才能到达目标器官。
2.1 血液
基因载体进入血液后，会迅速遭遇血浆蛋白、脂蛋白、红细胞和血小板等组分的挑战。其中，调理素（如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、C反应蛋白、IgG、IgM、C3补体蛋白片段）在载体表面的吸附形成“蛋白冠”，这极大地影响了载体的命运，通常导致其被肝脏、脾脏和骨髓中的单核吞噬系统（MPS）巨噬细胞在约10分钟内清除。载体的理化性质（如尺寸、形状、表面组成）决定了蛋白冠的组成。疏水和强电荷表面更易引发调理作用和补体激活。采用聚乙二醇（PEG）修饰或嫁接耐受性信号（如CD47）是减少清除的常见策略。反之，也可设计载体以促进吸附抑制吞噬的“失调素”（如富含组氨酸的糖蛋白、人血清白蛋白）。
2.2 肝脏
肝脏作为主要过滤器官，是系统给药基因载体的主要蓄积部位。肝窦状腔内有库普弗细胞（肝巨噬细胞），衬有肝窦内皮细胞（LSEC）。LSEC的窗孔（<6 nm）允许小于100 nm的载体（如AAV，约25 nm）外渗至窦周隙（Disse间隙），进而与肝细胞等相互作用。而100-200 nm的颗粒更易被库普弗细胞吞噬。肝脏靶向基因疗法在临床上应用广泛，部分得益于内源靶向机制：例如，载脂蛋白E（ApoE）富集的蛋白冠可促进载体通过低密度脂蛋白受体（LDLR）被肝细胞摄取；AAV8则通过37/67 kDa层粘连蛋白受体（LamR）实现高效的肝细胞转导。
2.3 脾脏
作为次级淋巴器官和血液过滤器，脾脏是200-500 nm尺寸范围内颗粒的主要蓄积场所。脾脏结构分为红髓（RP，含吞噬细胞）、白髓（WP，含淋巴细胞）以及分隔两者的边缘区（MZ，含MZ巨噬细胞和B细胞）。靶向脾脏淋巴细胞需要载体避免被RP区的网状内皮细胞吞噬。同时，MZ细胞可通过产生载体特异性IgM引发加速血液清除（ABC）现象，影响重复给药疗效。
2.4 肺
肺部毛细血管直径小（5-10 μm）且迂曲，血流动力学阻碍了纳米载体与内皮的相互作用。此外，肺血管内皮糖萼作为静电和空间屏障进一步增加了递送难度。尺寸在微米级的颗粒易因机械滞留而积聚在肺部毛细血管，但难以有效穿越紧密连接或被肺内皮细胞高效摄取。带正电的载体因与带负电的糖萼相互作用，更易在肺部积累，但需注意避免引发肺血管血栓等脱靶效应。
2.5 淋巴管
淋巴系统是维持体液和免疫稳态的关键。要实现淋巴结靶向，载体需先从血管外渗至组织间隙，然后通过淋巴管内皮细胞间的“纽扣连接”进入淋巴管。直径小于100 nm、低硬度、表面高度PEG化的纳米颗粒显示出更优的淋巴运输特性。进入淋巴系统后，载体会随单向淋巴流必然流经淋巴结，与其中的免疫细胞相互作用。
2.6 大脑
血脑屏障（BBB）是中枢神经系统（CNS）药物递送的主要挑战。BBB由紧密连接的内皮细胞构成，严格控制物质进出。分子量小于500 Da的脂溶性药物可被动扩散通过，而大多数纳米载体无法被BBB上特定的转运体识别。除了依靠载体尺寸、电荷等物理特性的被动扩散，穿越BBB主要依赖内源性和主动靶向机制（如利用特定受体介导的转胞吞作用）。
2.7 其他难以触及的器官系统
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心脏：心肌被内皮屏障与血液分隔，且受强烈血流冲刷，靶向难度大。AAV8在静脉给药后显示出相对较高的心脏基因表达。
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肾脏：肾小球滤过屏障（GFB）由多层不同孔径的结构组成（内皮窗孔70–100 nm，基底膜4–10 nm，裂孔隔膜35–45 nm），严格限制了可通过的颗粒尺寸（约<10 nm）。此外，带负电的GFB会阻碍带负电的载体通过。
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胎盘：胎盘屏障随妊娠进展变薄，分子量小于500 Da的药物可被动扩散。纳米颗粒的尺寸、电荷和硬度影响其穿越能力，近期研究显示增加LNP刚度（如添加β-谷甾醇）可增强其在胎盘的摄取并减少肝脏积累。
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骨髓：骨髓屏障（BMB）的窦状内皮孔径约61 nm，限制了纳米载体的进入。造血干细胞（HSC）稀有且难转染，目前临床以体外基因编辑为主。有研究显示，表面富集ApoE的LNP具有骨髓靶向能力。
3 基因递送平台
3.1 腺相关病毒（AAV）
3.1.1 AAV的结构与功能
AAV是无包膜病毒，衣壳由VP1、VP2、VP3蛋白以1:1:10的比例组装成二十面体对称结构，直径约20 nm。其单链DNA基因组约4.7 kb，包含末端反向重复序列（ITR）、复制（rep）和衣壳（cap）基因。重组AAV用目的基因替换rep和cap基因。AAV通过识别细胞表面糖类和蛋白聚糖（如半乳糖、唾液酸、硫酸乙酰肝素）以及辅助受体（如FGF受体、LamR、整合素）启动结合，随后经由AAV受体（AAVR，即KIAA0319L）介导的内存作用进入细胞。
3.1.2 AAV基因递送的免疫学屏障
AAV的免疫原性与血清型、剂量、靶组织有关。其基因组可通过模式识别受体（如TLR9）触发先天免疫反应。反复使用相同血清型会引发针对衣壳蛋白的中和抗体，降低疗效。高剂量AAV可能在某些组织（如肝、肺、心脏）引发免疫毒性（如细胞因子风暴）。虽然AAV基因组通常不整合入宿主基因组，但在高剂量或特定血清型下存在插入突变风险。约80%人群存在预存抗AAV中和抗体，是AAV疗法广泛应用的主要挑战。
3.1.3 AAV的内源靶向与生物分布
不同AAV血清型因其衣壳蛋白差异，具有独特的组织嗜性。研究显示，AAV1、2、5、6、7、9主要在肝脏和下肢表达；AAV4在肺和肾表达较高；AAV6和AAV8在心脏有表达；AAV9则表现出广泛的全身性转导，尤其在肝脏和中枢神经系统。另一项研究进一步证实，除AAV3B和AAV4外，多数血清型主要在肝脏转导，凸显了实现肝外基因递送的挑战。
3.1.4 AAV衣壳工程——设计方法
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定向进化：通过易错PCR等技术在衣壳蛋白基因中引入随机突变，构建变异库，随后筛选具有更优特性（如更高转导效率、更低免疫原性）的衣壳变体。
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噬菌体展示：将多样化的衣壳蛋白展示在噬菌体表面，高通量筛选与特定配体或细胞类型高亲和力的变体，用于开发具有增强组织特异性的AAV。
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理性设计：创建嵌合/杂交AAV载体，组合不同血清型衣壳蛋白以获得理想特性（如降低免疫原性、改变组织嗜性）。此外，基于对AAV衣壳-受体相互作用结构的理解，可理性改造结合域以增强靶向性或优化细胞内解包。
3.1.5 AAV衣壳工程——筛选方法
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体外筛选：在细胞模型上评估AAV衣壳变体库的转导效率，快速识别具有改进递送能力、特定组织趋向性或免疫逃避能力的变体。
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体内筛选：在动物模型中进行筛选，能更真实地反映载体穿越复杂生理屏障、逃避免疫清除并到达靶组织的能力，是发现具有临床应用潜力变体的关键步骤。
