分子尺度调控物理化学性质：基于硫醇-甲基砜交联的水凝胶用于细胞封装

《Macromolecular Bioscience》：Thiol-Methylsulfone Crosslinked Hydrogels for Cell Encapsulation: Molecular Scale Modulation of Physiochemical Properties

本文研究报道了一种用于三维细胞封装的水凝胶交联新技术。通过将四唑环对位取代基从给电子基团换为吸电子基团，成功设计了新型星形聚乙二醇-4-(5-(甲基磺酰基)-1H-四唑-1-基)苯甲酰胺（PEG4-CONH-TzMS）预聚物。该设计不仅简化了合成路径，提升了关键中间体的稳定性，更显著加快了水凝胶的成胶动力学（约60秒），并获得了更高的最终储能模量（≈3705 Pa）。所形成的水凝胶在细胞培养条件下展现出优异的长期稳定性，并成功实现了L929成纤维细胞的高活力（>90%）封装与均匀三维分布。这项工作为细胞封装和组织工程提供了一种合成更简便、性能更优的新型交联化学工具。

　　

引言背景

三维培养技术和细胞疗法的发展，依赖于能够将细胞封装在支持其增殖和自我组织的微环境中。天然或合成水凝胶作为细胞支架，在体外和体内组织工程中扮演着重要角色。理想的细胞封装水凝胶需满足生物相容性、生理条件下可反应性以及合适的成胶动力学。成胶时间过短（数秒）不利于前体与细胞的充分混合，易导致细胞分布不均；过长（数分钟至数小时）则可能因细胞沉降而影响均匀性。硫醇介导的反应因其高反应性、选择性及反应动力学可在生理pH范围内调节等优势，成为细胞封装水凝胶交联的常用策略。其中，硫醇-迈克尔加成反应（与马来酰亚胺或乙烯基砜）应用广泛，但前者反应过快（数秒内完成），后者则过慢，均不利于细胞的均匀分布。作为一种替代策略，硫醇-甲基砜（MS/SH）反应提供了介于两者之间的反应动力学，能在生理条件下形成稳定的硫醚键，无需光或热活化，此前已被用于星形聚乙二醇水凝胶的细胞封装。然而，该体系仍面临成胶动力学精细调控和预聚物合成流程优化两大挑战。

设计、合成与表征

为应对上述挑战，本研究聚焦于四唑甲基砜（TzMS）衍生物。前期研究表明，TzMS能在数分钟内成胶，是细胞封装的理想候选。本研究通过在TzMS芳香环的对位（p-位）引入吸电子取代基，设计并合成了新型预聚物——星形聚乙二醇-4-(5-(甲基磺酰基)-1H-四唑-1-基)苯甲酰胺（PEG4-CONH-TzMS），并将其与含有给电子连接基的已知变体PEG4-O-TzMS进行对比。

合成路径方面，PEG4-CONH-TzMS的制备以4-(5-巯基-1H-四唑-1-基)苯甲酸为起始原料，经S-甲基化、氧化为甲基砜，再将羧酸活化为五氟苯酚酯，最后与末端胺基（-NH₂）的四臂PEG反应。该路线仅需3步反应、2次柱层析纯化即可获得关键中间体，总产率28%，且中间体在干燥状态下于4°C可稳定储存超过6个月。与先前报道的PEG4-O-TzMS合成路线（需4步反应、4次柱层析，且关键胺中间体极不稳定）相比，新路径显著简化了合成、提高了中间体稳定性并降低了成本。

通过核磁共振氢谱分析证实，PEG4-CONH-TzMS预聚物在氘代磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中储存20天后仍保持>90%的完整性。与小分子巯基乙醇的反应在10分钟内即可完全转化，且反应产物在缓冲液中至少6天内保持稳定，证明了其在生理相关条件下的良好反应性与产物稳定性。

水凝胶的成胶动力学与稳定性

使用聚乙二醇二硫醇作为交联剂，通过原位振荡剪切流变学评估了水凝胶的成胶动力学。结果显示，PEG4-CONH-TzMS水凝胶在混合后约1分钟即达到50 Pa的储能模量（t_50Pa≈ 1 min），并在40分钟后达到约3705 ± 844 Pa的最终储能模量（G′_{40 min}）。相比之下，PEG4-O-TzMS的t_50Pa为11分钟，G′_{40 min}为1751 ± 85 Pa。这表明吸电子酰胺连接基的引入，通过降低MS碳原子的电子密度，显著加速了亲核芳香取代反应，使成胶动力学加快了约11倍，同时最终水凝胶的机械强度也提高了约2倍。

形成的PEG4-CONH-TzMS水凝胶在宏观上透明均一。将其置于标准细胞培养条件（含10%胎牛血清的RPMI培养基，pH 7.5, 37°C）下孵育超过15天，通过明场成像和纳米压痕测试均未观察到水凝胶尺寸或表面形态的显著变化，其杨氏模量保持稳定，证明了该水凝胶在细胞培养条件下的长期稳定性。

细胞封装与生物相容性评估

为验证PEG4-CONH-TzMS水凝胶在细胞培养中的适用性，研究将L929成纤维细胞作为模型细胞进行三维封装。预聚物先用细胞粘附性环RGDfC肽进行生物功能化，再与细胞悬液混合，最后通过含两个半胱氨酸的基质金属蛋白酶可裂解肽交联。混合物在>30秒内保持低粘度，便于低剪切力下的移液操作。共聚焦Z-stack图像显示，细胞在水凝胶厚度方向上分布均匀。活/死染色实验表明，封装1天后细胞活力超过90%，且在长达3天的培养中活力未受影响。

为评估封装细胞的功能，进行了细胞迁移实验。将成纤维细胞球状体封装于水凝胶中，观察到细胞在3天内发生铺展和活跃迁移（约50 μm/天），这表明细胞既能识别RGD粘附配体，也能通过酶解作用降解VPM交联肽键，证明了水凝胶支持细胞活动和基质重塑的能力。

讨论与结论

本研究成功开发了一种新型的PEG4-CONH-TzMS水凝胶体系。通过将对位取代基从给电子基改为吸电子酰胺基，实现了对硫醇-甲基砜交联反应动力学的有效调控，将成胶时间优化至约60-90秒的理想范围。这一改进不仅解决了快速均匀封装细胞的工艺需求，还获得了更高力学性能的水凝胶。

在合成上，新路线步骤更少、纯化更简便、关键中间体稳定性大幅提升，有利于大规模制备。稳定性测试和细胞实验证实，这种电子特性的改变并未损害水凝胶前体或反应产物在生理条件下的稳定性，且保持了优异的生物相容性，支持细胞的高活力封装、均匀分布和功能性迁移。

综上，这项工作通过分子尺度的精细设计，为细胞封装和组织工程提供了一种合成更简便、性能更优（成胶更快、模量更高、稳定性好）的新型交联化学工具。稳定的中间体也为其拓展至其他生物相容性聚合物骨架（如八臂PEG、聚乙烯醇、明胶、肝素等）提供了便利，展示了广泛的应用潜力。