《Macromolecular Bioscience》：Biocompatibility of Hydrogels for Glomerular 3D Co-Culture: A Comparative Analysis
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本文旨在寻找能够支持肾小球细胞长期三维共培养的最佳水凝胶基质，以克服传统二维培养在模拟体内复杂微环境方面的局限。研究系统比较了五种水凝胶——Matrigel、ADA-GEL、纤维蛋白、重组蜘蛛丝蛋白eADF4(C16)-RGD和烯丙基修饰明胶(GelAGE)——在细胞活力、支持生理性细胞行为及机械特性等方面的表现。最终，GelAGE与蜘蛛丝蛋白在生物相容性和结构支持方面脱颖而出，被确定为构建具有生理相关性的三维肾小球模型、推动肾脏组织研究的理想候选材料。
引言
肾脏的功能单位是肾单位，它由一个肾小球和一个肾小管系统组成。肾小球滤过屏障由肾小球内皮细胞、肾小球基底膜以及具有相互交错足突和其间裂孔膜的足细胞构成。此外，肾小球内的系膜细胞与内皮细胞和足细胞相互作用，并通过产生细胞外基质(ECM)来维持肾小球结构。
传统的二维单层培养无法充分再现肾小球复杂的结构。本实验室先前建立了三维自组装肾小球球体，并显示出与二维相比，在三维环境中与肾小球功能相关基因的表达增强。然而，这些球体迄今为止缺乏血管化和环境信号，限制了它们向更高层级肾小球样结构的应用。一种有前景的策略是通过将细胞接种在水凝胶中来生成生物人工组织。水凝胶是具有高含水量和高溶胀率的三维聚合物网络，可为细胞提供水合度高且具有机械支持性的三维环境。在选择用于模拟特定组织的水凝胶时，其材料特性必须满足不同的细胞需求和功能。
本研究旨在模拟肾小球细胞的三维环境，使用由永生化人足细胞、肾小球内皮细胞和系膜细胞组成的球体，并将其包埋在不同的水凝胶中。目标是寻找最佳的水凝胶，以提供模拟ECM的环境，确保肾小球共培养物随时间推移具有高细胞存活率，并为未来的血管化创造条件。
Matrigel作为肾小球细胞的ECM模拟环境
Matrigel是一种从小鼠肉瘤细胞衍生的商业化可溶性基底膜基质，富含层粘连蛋白和胶原蛋白IV，是肾小球细胞培养的有前景支架。包埋在Matrigel中的人肾小球系膜细胞(hMCs)保持活力、增殖并显示出铺展行为。培养四天后，细胞自组织成三维球状结构。然而，由于凝胶快速降解，无法进行培养基更换、固定和染色，Matrigel被认为不适合继续进行三维肾小球共培养实验。
ADA-GEL作为肾小球细胞的ECM模拟环境
单独使用明胶缺乏足够的热稳定性。为了解决这一限制，我们将明胶与醛基化海藻酸钠(ADA)结合，通过钙离子进行离子交联，从而增强水凝胶的结构稳定性。添加微生物转谷氨酰胺酶(mTG)提供了针对明胶组分的二次交联机制，进一步提高了复合水凝胶的机械完整性。然而，ADA-GEL批次间的差异过大，无法保证水凝胶的可重复一致性。凝胶不稳定，尽管添加mTG和CaCl2能大幅减缓基质降解，但细胞增殖行为受到影响。ADA-GEL水凝胶不透明，无法进行清晰的明场成像。活/死染色显示系膜细胞在五天后仍存活，但大多数细胞从基质中铺展出来。总之，由于稳定性不一致、透明度不足以及对肾小球内皮细胞有细胞毒性作用，ADA-GEL不适合用于肾小球三维共培养。
纤维蛋白凝胶作为肾小球细胞的ECM模拟环境
接下来，测试了纤维蛋白作为肾小球培养的水凝胶。通过将浓度为50 IU/mL的凝血酶加入纤维蛋白原中生成纤维蛋白凝胶，凝血酶催化纤维蛋白微纤维的形成，构成三维网状结构。与ADA-GEL类似，基于纤维蛋白的凝胶不透明，阻碍了清晰的明场成像，并随时间逐渐降解。荧光活/死染色显示，人系膜细胞和人肾小球内皮细胞(hGECs)在较高纤维蛋白原含量的凝胶中存活，细胞的三维结构能够在凝胶内铺展。人足细胞(hPodocytes)也能在纤维蛋白凝胶中存活。然而，纤维蛋白凝胶快速降解（七天内），使得超过数天的细胞培养变得不可能。随后添加了蛋白酶抑制剂抑肽酶。尽管与不加抑肽酶时最多七天相比，纤维蛋白凝胶的稳定性可延长至14天，但足细胞的良好细胞形态和存活率显著下降，使得这种方法对肾小球组织工程无效。纤维蛋白凝胶的另一个局限是其光学透明度差，阻碍了清晰的免疫荧光成像。因此，纤维蛋白被认为不适合支持肾小球三维共培养系统。
蜘蛛丝作为肾小球共培养的ECM模拟环境
蜘蛛丝以其良好的生物相容性而闻名，因此蜘蛛丝基水凝胶是肾小球共培养的一个有前景的候选材料。使用经RGD序列修饰的3%蜘蛛丝凝胶测试了人足细胞、人系膜细胞和人肾小球内皮细胞的单培养以及共培养。尽管凝胶稠度相对较软，但蜘蛛丝基凝胶保持稳定超过三周，可以用4%多聚甲醛固定并进行染色。虽然二维肾小球单培养在蜘蛛丝凝胶中仅显示出中等存活率，但三维肾小球共培养的活力明显优于其他水凝胶。到第14天，细胞从球体中迁移出来并形成扩张的、类似支架的结构。随后测试了添加血管内皮生长因子-A(VEGF-A)涂层纤维或与胶原蛋白IV复合的凝胶，以改善肾小球ECM模拟环境。然而，含有VEGF-A涂层聚左旋乳酸(PLLA)纤维的共培养球体并未显示出预期的细胞活力改善效果。同样，在蜘蛛丝-胶原蛋白IV复合水凝胶中包埋的球体也未观察到活力改善。培养14天后，用光片显微镜对人系膜细胞、人肾小球内皮细胞和足细胞的肾小球共培养物进行成像，以获取高分辨率三维图像。细胞从球体中长出并形成三维支架样结构。
在确立蜘蛛丝作为肾小球共培养的合适水凝胶后，研究了肾小球细胞如何与基质相互作用以及凝胶特性是否随时间变化。通过初始循环加载测试表征了无细胞凝胶的基线机械性能。为了确定肾小球细胞对蜘蛛丝水凝胶复杂机械性能的影响，对包埋有肾小球球体的蜘蛛丝水凝胶进行了压缩和扭转剪切下的循环加载和应力松弛测试，并评估了包括非线性、滞后、条件化和应力松弛在内的复杂机械特性。直到第7天，含有肾小球细胞的蜘蛛丝水凝胶表现出更明显的非线性、滞后行为，循环加载过程中名义应力增加，但与第0天相比，其条件化效应相似。随着细胞网络随时间成熟，从第0天到第1天/第7天，压缩和扭转剪切下的名义应力显著增加。从第7天到第14天，机械性能中的名义应力仅有轻微但不显著的下降。在应力松弛测试期间，含有肾小球细胞的蜘蛛丝水凝胶表现出典型的粘弹性行为，在第0天压缩下可快速松弛高达85%，扭转剪切下高达42%，但在300秒后未达到扭转剪切下的平衡应力值。从第0天到第14天，所有加载模式下的粘性效应均呈现持续下降的趋势，这可归因于聚合物链网络内细胞网络的成熟。
总之，蜘蛛丝似乎是适合肾小球共培养实验的水凝胶。然而，蜘蛛丝材料需要高水平的专业知识来评估两个最重要的参数——时间和温度，以确保水凝胶提供相同的质量、良好的操作性能和样品耐久性。在没有特殊重新调整的情况下，这种水凝胶使用起来更复杂，需要根据各自的实验室条件进行适应。
GelAGE作为肾小球共培养的ECM模拟环境
GelAGE具有出色的操作特性，既具有光学透明度以进行高质量成像，又可通过紫外光交联聚合实现高度稳定。通过混合GelAGE变体G2LH、四臂硫醇化聚乙二醇(PEG-4-SH)和作为光引发剂的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(LAP)生成GelAGE基凝胶。成熟一天后，将肾小球球体混合到水凝胶悬浮液中。使用紫外辐射固化GelAGE。短暂的紫外线照射交联不影响细胞活力。
在GelAGE中，人系膜细胞和人肾小球内皮细胞的单培养显示出中等存活率，但足细胞单培养在几天后显示出细胞死亡。相比之下，肾小球共培养物可以在GelAGE中保持长达14天。从培养第1天开始，细胞从球体中铺展出来并形成细胞网络。与蜘蛛丝类似，假设VEGF-A可能增加GelAGE中的细胞活力和细胞相互作用。因此，比较了包埋在添加VEGF-A涂层纤维的GelAGE中的肾小球球体与标准GelAGE水凝胶中的细胞存活率。然而，VEGF-A涂层纤维并未改善GelAGE中细胞的活力。为了进一步表征水凝胶，使用低温扫描电子显微镜(cryo-SEM)检查了其孔结构。比较了不含以及含肾小球共培养物的GelAGE水凝胶在孵育一天和七天后的情况。随着时间的推移，细胞遍布凝胶、分裂或形成细胞连接。因此，七天后，细胞周围的区域显示出通道样结构。
与对蜘蛛丝基凝胶所做的工作类似，研究了肾小球细胞如何与GelAGE相互作用以及凝胶特性是否随时间变化。首先，在没有细胞的情况下进行了循环加载测试，并确定了包括非线性、滞后和条件化在内的复杂机械性能。虽然从第0天到第1天，所有加载模式下的名义应力、非线性、滞后和条件化均有所增加，但材料性能在第7天和第14天保持相似。
对含有包埋肾小球球体的GelAGE水凝胶进行了压缩、拉伸和扭转剪切下的循环加载和应力松弛测试，并系统评估了包括非线性、滞后、条件化和应力松弛在内的关键机械特性。从第7天开始，含有肾小球细胞的GelAGE水凝胶在循环加载过程中表现出更明显的非线性行为，名义应力增加，但与第0天/第1天相比，滞后行为和条件化效应相似。随着细胞网络随时间成熟，从第0天/第1天到第7天/第14天，压缩下的名义应力显著增加，拉伸和扭转剪切下略有增加但不显著。机械性能从第7天到第14天没有进一步变化，很可能归因于孵育七天后形成了高度发达的细胞网络。
在应力松弛测试期间，含有肾小球细胞的GelAGE水凝胶表现出典型的粘弹性行为，在第0天压缩下松弛高达37%，拉伸下高达55%，扭转剪切下高达17%，且在300秒内未达到平衡应力值。随着时间的推移，从第0天到第14天，除第1天到第7天之间的拉伸外，所有加载模式的粘性效应普遍呈下降趋势。这种粘性反应的降低可能反映了聚合物基质内细胞网络的成熟。第7天拉伸的例外情况可能是由于该时间点应力松弛数据的偏差所致。
讨论
我们对许多基于细胞过程的理解源于在诸如聚苯乙烯和玻璃等平坦、坚硬材料上进行的二维实验。在这些条件下培养的细胞显示出非生理性的形状和极化、对药物试剂的反应改变以及分化表型的丧失。为了更好地模拟生物环境以获得具有转化意义的体外实验结果，需要更能模拟生物环境的培养模型。特别是在肾小球中，多种细胞直接和间接相互作用以实现正常功能，二维单层培养无法再现体内情况。此外，需要放大培养的机会，但没有支持多个细胞亚单位细胞外稳定性和凝聚力的支架是不可能的。水凝胶已被证明可以控制机械、组成和结构信号，从而在细胞培养中更准确地代表天然组织的特征。
本研究旨在寻找一种合适的水凝胶配方，以支持长期的肾小球三维共培养。选择水凝胶时应考虑许多因素，包括凝胶的操作性、对细胞的粘附性、培养中的稳定性、所有相关细胞类型的存活率、以及特定感兴趣细胞类型的行为和生物物理特性。由于大多数其他研究仅测试其基质对一种或两种细胞系的效果，我们在此强调，匹配每种细胞类型的所有需求至关重要。
我们首次测试了五种不同的水凝胶用于肾小球球体培养，以识别那些最适合在具有ECM样结构的三维环境中进行长期培养的材料。
Matrigel在过去几年中已被广泛应用于各种实验设置中。它是一种有前景的肾小球共培养水凝胶，因为它含有胶原蛋白和层粘连蛋白，这些也存在于肾小球ECM和肾小球基底膜中。Matrigel非常柔软，因此允许人系膜细胞铺展。然而，它非常不稳定，凝胶在细胞培养基中仅几天后就溶解了，因此被认为不适合肾小球共培养模型。
尽管ADA-GEL在精确的mTG浓度下对系膜细胞是稳定的，但这种凝胶显示出巨大的批次间差异，透明度不够导致成像背景，并对细胞显示出一定的毒性。此外，由于ADA-GEL在这些细胞存在下持续溶解，培养肾小球内皮细胞和足细胞是不可能的。
人肾小球系膜细胞和人肾小球内皮细胞在纤维蛋白基凝胶中存活并铺展。然而，这种凝胶也降解得非常快（七天内），并且增加抑肽酶浓度以稳定凝胶会影响细胞存活。由于凝胶外观不透明，通过凝胶成像很困难。
生物相容性、生物可降解性以及在环境条件下于水溶液中加工的潜力使得丝基材料成为组织工程的有前景的支架。对于水凝胶生成，富含β-折叠的蜘蛛丝纳米原纤维的自组装成核-聚集之后是浓度依赖性的凝胶化。因此，蜘蛛丝似乎是肾小球共培养模型的良好选择，因为它显示出良好的生物相容性、稳定性和可修饰性。足细胞、肾小球内皮细胞和系膜细胞在这种凝胶的三维共培养中均显示出良好的存活率。光片显微镜能够可视化在蜘蛛丝中接种的球体中细胞的生长。此外，对含有肾小球球体的蜘蛛丝水凝胶的机械表征揭示了多模态机械响应的变化，包括明显的非线性、孵育1天后压缩和扭转剪切下最大名义应力的增加，以及由于孵育1天后细胞成熟而导致的粘弹性效应略有减弱。
然而，蜘蛛丝的缺点包括需要大量专业知识，并且关键步骤只能在一定经验水平下控制。这种材料在水凝胶制造过程中对时间和温度非常敏感。然而，通过进一步调整操作过程，可以获得优异的样品质量。其他水凝胶可能更适合快速简便的操作。尽管如此，这种基质对肾小球细胞具有良好的特性。
明胶先前已成功用烯丙基官能团(GelAGE)修饰并通过紫外辐射交联。然而，GelAGE尚未在组织工程和三维细胞培养应用中进行详尽研究。由足细胞、肾小球内皮细胞和系膜细胞组成的肾小球球体存活长达14天。因此，所有三种肾小球细胞类型的细胞存活时间在GelAGE中最长。此外，这种凝胶足够稳定和透明，可用于成像分析。不仅共聚焦显微镜，而且多光子显微镜也能够可视化凝胶内的细胞，这些细胞从球体中铺展出来。据作者所知，本研究首次系统、深入地研究了肾小球球体对GelAGE水凝胶复杂机械性能的影响，并证实了多模态机械响应的变化，包括明显的非线性、孵育7天后最大名义应力的增加以及由于细胞成熟而导致的粘弹性效应略有减弱。然而，无细胞GelAGE水凝胶在无侧限压缩下从第0天到第14天的最大名义应力增加趋势与我们先前针对低GelAGE浓度的GelAGE水凝胶的研究一致。
结论
这是首次研究五种不同的水凝胶用于由三种不同细胞类型组成的肾小球三维共培养，这些水凝胶是大规模制备的。研究发现GelAGE为肾小球球体提供了最佳的ECM，并允许培养细胞生长长达14天。共聚焦和多光子显微镜能够可视化凝胶内的细胞，对含有肾小球球体的GelAGE和蜘蛛丝水凝胶的机械表征揭示了水凝胶的粘弹性效应，这对于细胞在基质内的铺展和增殖非常重要。因此，GelAGE和蜘蛛丝可能是未来肾小球共培养模型的良好选择。
实验方法
该研究详细描述了细胞培养、球体制造、VEGF-A涂层PLLA纤维生产、细胞/球体接种到水凝胶、活/死染色、Calcein-Hoechst染色、共聚焦显微镜、多光子显微镜、光片显微镜以及各种水凝胶（Matrigel、ADA-GEL、纤维蛋白凝胶、eADF4(C16)-RGD水凝胶、GelAGE）的制备方法。此外，还包括了用于结构分析的低温扫描电镜和用于复杂机械表征的多模态机械测试方案。图形示意图使用BioRender创建。
致谢、基金与利益冲突
作者感谢项目中的技术支持。本研究由德国研究基金会(DFG)资助。作者声明无利益冲突。支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获取。
