《BioEssays》：Histone Nuclear Import and Beyond: Multifunctional Roles of Importins
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本文探讨了组蛋白核输入领域的最新进展。输入蛋白不仅是组蛋白的“搬运工”，还扮演着“保护者”和“递送员”的角色。作者综述了核心组蛋白H3-H4、H2A-H2B以及连接组蛋白H1通过特定输入蛋白（如Importin-4/Kap123、Importin-9/Kap114和Impβ-Imp7异二聚体）被精准运入细胞核的分子机制。文章特别强调了近年来的结构生物学研究（如冷冻电镜）如何揭示输入蛋白如何与组蛋白及其分子伴侣（如ASF1、Nap1）形成复合物，以保护组蛋白免受异常相互作用，并协同RanGTP信号实现核内释放与核小体组装。这篇综述将输入蛋白定位为染色质稳态调控中的关键整合因子，并提出了未来关于备份输入蛋白、组蛋白翻译后修饰（PTMs）影响以及输入蛋白是否直接参与核小体组装等开放性问题。
1 引言
在真核细胞中，双层的核膜将细胞核内的DNA相关过程与细胞质的其他活动分隔开。这种区室化要求DNA结合蛋白（如组蛋白）必须高效地跨核膜运输，同时避免发生非特异性相互作用。组蛋白是高度碱性的小蛋白质，它们是构成染色质基本单元——核小体的核心。每个核小体核心由约147个碱基对的DNA缠绕在由四个核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成的八聚体上构成（如图1所示）。组蛋白翻译后修饰（PTMs），如乙酰化、甲基化等，进一步调控其功能，影响DNA的可及性以及转录、复制和修复等过程。由于组蛋白易于聚集，从合成到沉积至染色质的整个过程中，它们始终需要组蛋白伴侣的保护。经典的组蛋白伴侣（如ASF1、Nap1）不能自行通过核孔复合体（NPC），因此组蛋白的核输入依赖于输入蛋白家族成员的介导。本综述将聚焦于核心组蛋白和连接组蛋白通过输入蛋白进行核输入的机制，并探讨输入蛋白作为转运体和分子伴侣的双重功能。
2 核心组蛋白由Karyopherin-β家族核输入受体转运
输入蛋白属于Karyopherin-β（Kap）家族，是柔性的、带负电荷的蛋白，通常由20-24个串联的HEAT重复单元构成。它们能够结合货物和核孔蛋白，从而介导货物通过NPC。转运的方向性由小GTP酶Ran的不对称分布控制：RanGTP富集于核内，而RanGDP富集于胞质。输入蛋白与货物和RanGTP的结合是互斥的，这种机制保证了单向转运。许多蛋白货物携带核定位信号（NLSs）介导与输入蛋白的结合。然而，近期研究发现输入蛋白也能识别非线性的或结构化的基序。核心组蛋白异二聚体（H3–H4和H2A–H2B）正是通过其组蛋白折叠结构域直接与各自的输入蛋白结合。
3 Importin-4是组蛋白H3和H4的关键核输入蛋白
3.1 来自细胞和生物化学研究的见解
从HeLa细胞胞质中纯化出的组蛋白H3.1/H3.3和组蛋白伴侣ASF1复合物的生化分析揭示了H3和H4从合成到核输入的级联性伴侣相互作用。新合成的组蛋白首先由HSC70折叠，随后与HSP90和NASP相互作用促进H3–H4二聚化。ASF1–H3–H4随后主要被传递给Importin-4，以及较少程度地传递给Importin-5，进行核输入。在细胞核内，RanGTP与Importin-4的结合可能触发ASF1–H3–H4的释放，使得ASF1能将H3–H4传递给CAF-1进行复制耦合的沉积，或传递给HIRA进行复制不依赖的组装。在酵母和人类细胞中的互补研究确定了负责组蛋白输入的Kaps。酵母细胞提取物显示Kap123是主要的H3/H4结合蛋白，而人类细胞胞质提取物同样鉴定了其同源物Importin-4。由于H3和H4的N端尾巴富含碱性氨基酸，类似经典的NLS，多个研究组使用核输入和下拉实验来定位潜在的NLS基序。然而，尽管这些肽段片段可以与多种输入蛋白结合，但细胞观察表明Importin-4/Kap123是主要的输入蛋白。
3.2 Kap123/Importin-4如何识别H3和H4以进行核输入
近期冷冻电镜（cryo-EM）技术的进步使得研究者能够解析全长的Importin-4与酵母ASF1和爪蟾（Xenopus laevis） H3–H4结合的结构。该结构揭示了输入蛋白和组蛋白伴侣如何共同结合组蛋白异二聚体，并提供了Importin-4作为组蛋白“共伴侣”的首个实例。Importin-4/Kap123与Importin-5/Kap121在进化上关系密切，它们都具有通过分子内相互作用形成的闭合超螺旋结构。在Importin-4–H3–H4–ASF1结构中，ASF1以与其先前晶体结构相同的方式结合H3–H4。与其他H3–H4复合物类似，H3的αN螺旋相对于组蛋白折叠结构域采取不同的取向，这种构象灵活性可能有助于组蛋白在伴侣之间的传递。
4 其他输入蛋白在H3和H4核输入中起次要作用
除了Importin-4/Kap123，其他几种输入蛋白也参与H3和H4的核输入。下拉实验和输入蛋白缺陷菌株的核定位分析鉴定出Kap121和Kap104作为额外的输入蛋白。相应地，其人类同源物Importin-5和TNPO1在胞质提取物中也能结合H3–H4，特别是在Importin-4被耗尽的情况下。虽然大多数证据支持H3和H4以异二聚体形式输入，但最近的研究表明一些胞质H3和H4池在核进入前仍保持单体状态，可能只在进入细胞核后才异二聚化。这些不能形成异二聚体的H3和H4物种在细胞中优先与Importin-5和NASP结合，这提示了可能存在多种组蛋白转运途径。
5 H3和H4尾巴的翻译后修饰（PTMs）与核输入
组蛋白PTMs是共价化学标记，调控组蛋白折叠、伴侣作用和染色质组装。H3和H4的PTMs大多发生在其N端尾巴的赖氨酸和精氨酸残基上。虽然这些尾巴对于核输入并非必需，但PTMs可以影响伴侣途径并间接调节输入蛋白的相互作用。最显著的胞质PTMs是H4在赖氨酸K5和K12的乙酰化。这些修饰稳定了H4与ASF1的结合，并促进其向Importin-4的转移，从而促进了高效的核输入和随后的染色质组装。尽管它们的直接贡献尚不清楚，但这些PTMs可能调节伴侣的结合或限制其与特定输入蛋白的结合。使用H3和H4尾巴的乙酰化模拟突变进行的生化研究结果不一。在酵母中，H3和H4尾巴的乙酰化模拟突变不影响细胞活力，这与PTMs仅起微调作用而非决定输入效率的观点一致。H3K4和H3K9的单甲基化和二甲基化已在可溶性、非核小体组蛋白上检测到。H3和H4的泛素化可能调控组蛋白周转、蛋白酶体降解或输入前的质量控制。总之，这些研究表明，虽然H3和H4的乙酰化增强了伴侣结合并间接促进了核输入，但它并非Importin-4识别所严格必需的。相反，组蛋白PTMs充当分子检查点，微调伴侣和输入蛋白的相互作用，防止聚集或降解，并确保只有正确组装的组蛋白被递送到细胞核进行染色质组装。
6 Importin-9/Kap114是H2A–H2B的主要核输入受体
6.1 H2A–H2B：从胞质合成到核小体组装
组蛋白H2A和H2B在胞质中的翻译后加工和运输仍知之甚少。从酵母和HeLa细胞提取物的下拉实验鉴定出组蛋白伴侣Nap1是H2A和/或H2B的胞质结合伙伴。类似的分析显示，Kap114及其人类同源物Importin-9是与H2A和H2B相关的主要输入蛋白。Nap1和Kap114经常与H2A和H2B共纯化，表明它们在核输入过程中可能形成三元复合物。进入细胞核后，Nap1可能与组蛋白伴侣FACT和/或Nucleoplasmin共同促进核小体沉积。
6.2 其他输入蛋白作为次要的H2A–H2B输入蛋白
与H3和H4类似，H2A和H2B可以与多种输入蛋白结合。在酿酒酵母中，Kap121和Kap123作为次要输入受体，在Δkap114菌株中结合H2A和H2B。相应地，Kap121和Kap114缺失突变体显示出H2A–H2B核输入显著受损。使用固定化组蛋白的下拉结合实验证明了H2A和/或H2B与酵母细胞的Kap114、Kap104、Kap123、Kap121和Kap95，以及人类细胞的Importin-9和-β的直接相互作用。HeLa细胞中的核定位研究进一步表明，H2A和H2B的N端尾巴及其组蛋白折叠结构域都可以介导核定位。
6.3 Importin-9和Kap114与H2A–H2B结合的结构分析
人类Importin-9-爪蟾H2A–H2B和酵母Kap114–H2A–H2B复合物的晶体和冷冻电镜结构揭示了这些同源输入蛋白如何识别组蛋白二聚体。两者都包含20个HEAT重复单元，形成开放的超螺旋结构，环绕着组蛋白折叠结构域。超螺旋缠绕着H2A–H2B，其N端和C端重复单元夹住组蛋白折叠结构域，以类似伴侣的方式屏蔽其DNA结合表面。
6.4 H2A–H2B不被RanGTP从Importin-9/Kap114上释放
与经典的核输入途径不同，RanGTP的结合不会触发货物H2A–H2B从Importin9或Kap114上释放。相反，它形成了稳定的复合物RanGTP–Kap114–H2A–H2B或RanGTP–Importin9–H2A–H2B。对RanGTP–Kap114/Importin-9–H2A–H2B复合物的冷冻电镜和氢-氘交换分析显示，RanGTP结合在其典型位置，而H2A–H2B则发生轻微重定向：其与输入蛋白C端HEAT重复单元的接触保持完整，但与N端重复单元的相互作用则丧失。这种重排暴露了组蛋白与核小体中H3–H4和DNA相互作用的界面，从而为H2A–H2B转移至组装中的核小体或核内伴侣做好准备。
6.5 RanGTP和Nap1协同作用将H2A–H2B从Importin-9/Kap114上释放
早期的生化研究表明，酵母Nap1在胞质和核提取物中都与H2A–H2B结合的Kap114相互作用，这意味着Nap1作为共输入因子发挥作用，并在随后促进组蛋白释放用于核小体组装。最近对Nap1–H2A–H2B–Kap114–RanGTP复合物的冷冻电镜结构揭示了Nap1和RanGTP如何协同伴侣作用和释放组蛋白二聚体。在这个四元复合物中，组蛋白被夹在Kap114和Nap1二聚体之间，而RanGTP结合在输入蛋白的N端重复单元上。与二元Kap114–H2A–H2B结构的比较表明，Nap1处于屏蔽H2A–H2B的位置，因为组蛋白从输入蛋白转移至下游核内伴侣或组装中的核小体。与存在Ran的复合物采用单一确定的构架不同，在没有RanGTP的情况下，Nap1–Kap114–H2A–H2B组装存在多种替代排列方式，这对高分辨率结构确定提出了挑战。这些包括H2A–H2B单独结合Kap114而Nap1与输入蛋白结合但不接触组蛋白的构型，以及组蛋白二聚体位于Kap114和Nap1二聚体之间并与两者相互作用的组装。这些离散状态的共存指向一个动态的相互作用景观，而非单一的静态结构。
7 Importin-7-Importin-β异二聚体将连接组蛋白H1转运入细胞核
7.1 连接组蛋白H1的伴侣系统
连接组蛋白H1的伴侣和输入途径仍不完全清楚，这在很大程度上是由于H1-伴侣复合物的动态性质。组蛋白伴侣tNASP、sNASP、TAF-1和Protα从HeLa和小鼠细胞提取物中与H1共同免疫沉淀，其中tNASP还与HSP90共纯化，这表明HSP90可能在H1传递给tNASP之前在胞质中参与H1的折叠。在爪蟾卵提取物中，Nap1和Nucleoplasmin也与H1相关。体外染色质重建实验表明，NASP、NAP1或TAF-1可以促进H1沉积到连接DNA上，而ProTα和Nucleoplasmin则促进H1从染色质上置换。下拉实验进一步在HeLa细胞提取物中鉴定出Importin-β、-α和-7是H1的相互作用伙伴，这促使了对这些输入蛋白如何伴侣作用和转运H1进入细胞核的深入研究。
7.2 H1与多种输入蛋白的相互作用
使用固定化全长H1与重组输入蛋白进行的体外结合实验表明，人类H1结合Importin-β和Importin-7，以及Importin-5和Transportin-1。值得注意的是，虽然Importin-β和-7各自可以单独结合H1，但Importin-β–Importin-7异二聚体的结合亲和力显著更高，并且两种输入蛋白都是细胞中H1有效核积累所必需的。H1由一个短的N端尾巴、一个中央的翼状螺旋球状结构域和一个长的C端尾巴组成——这是一种与核心组蛋白不同的结构域组织。核定位映射显示，包含其C端尾巴或球状结构域的片段都具有核靶向能力。C端片段结合Importin-5、-β、-7和Transportin-1，但只有Importin-β–Importin-7异二聚体能有效输入完整的C端尾巴。这些发现确立了Importin-β–Importin-7是连接组蛋白H1的主要核输入受体。
7.3 H1与Importin-β–Importin-7异二聚体结合的结构
Importin-β–Importin-7–H1复合物的低分辨率冷冻电镜图谱首次提供了该输入蛋白异二聚体如何识别人类H1的结构见解，显示出一个笼状构象，包裹着组蛋白的球状结构域。这个初始模型将H1球状结构域置于Importin-β的凹面上，而H1的C端尾巴与Importin-7接触。随后的AI引导建模结合交联数据修正了这一排列：是Importin-7，而非Importin-β，结合H1的球状结构域。在这个更新后的模型中，Importin-β和-7通过它们的C端HEAT重复单元相关联，形成一个延伸的U形超螺旋。Importin-7连接h19螺旋的酸性环介导了两种输入蛋白之间广泛的接触，而Importin-7的无序C端尾巴则与Importin-β的C端重复单元中的疏水口袋结合。H1的球状结构域结合在Importin-7的RanGTP结合位点附近，H1的C端尾巴可能穿行于两种输入蛋白之间。这种结合模式意味着，核内RanGTP与Importin-β的结合通过置换与Impβ结合的Imp7 C端区域，促进其从Importin-7–H1复合物中解离。随后H1从Importin-7上的释放机制仍未解决；可能是RanGTP直接取代Importin-7上的H1，或者是Nasp结合协助了解组装和核小体沉积。
8 总结
输入蛋白主动将经典组蛋白和连接组蛋白从细胞质转运到细胞核。在人类细胞中，Importin-4、Importin-9和Importin-β–Importin-7异二聚体分别是H3–H4、H2A–H2B和H1的主要核输入受体。其他输入蛋白如Importin-5和TNPO1可能作为备用或上下文特异性输入蛋白，可能识别组蛋白变体或PTM形式。除了转运功能，输入蛋白还作为组蛋白伴侣，保护高度碱性的组蛋白在前往核小体组装的途中免受非特异性相互作用。冷冻电镜结构揭示了Importin-4如何包裹H3的N端尾巴并与H3–H4的球状结构域接触；Importin-9如何封装H2A–H2B折叠；以及Importin-β–Importin-7异二聚体如何共同伴侣H1的球状结构域和C端尾巴。Importin-9还通过与Nap1和RanGTP的相互作用参与核小体组装，促进H2A–H2B转移到四聚体上。尽管近期取得了结构上的进展，但关于备用输入蛋白如何识别组蛋白、组蛋白变体或PTMs如何影响输入途径、输入蛋白在核小体组装中的潜在作用以及H1在细胞核内释放的机制等主要问题仍然存在。
9 关于组蛋白核输入及未来的开放性问题
9.1 次要（“备份”）组蛋白输入蛋白的作用是什么？
大约三分之一的核输入货物可以与多种输入蛋白结合，组蛋白就是这种冗余性的例证。特定的输入蛋白-货物配对可能取决于相对亲和力、表达水平和细胞环境。对于组蛋白，次要输入蛋白如Importin-5/Kap121和Transportin-1的作用仍不清楚。组蛋白折叠状态、PTMs或变体序列的差异可能调节输入蛋白的亲和力和途径选择。结合结构学和生物化学研究不同组蛋白类型与输入蛋白的结合对于解析这种调控至关重要。
9.2 输入蛋白在核小体组装或拆卸中发挥作用吗？
Importin-9/Kap114可以与RanGTP和Nap1合作将H2A–H2B递送至DNA的发现表明，核输入受体可能在核小体组装中发挥作用。同样，Importin-4与H3–H4–ASF1的强结合及其共伴侣作用也指向了可能的核功能。虽然RanGTP可以使组蛋白尾巴从输入蛋白上解离，但目前尚不清楚这是否适用于全长H3–H4–ASF1。结合RanGTP和DNA的Importin-4–H3–H4–ASF1的进一步结构和生化研究，以及核输入蛋白的蛋白质组学分析，可以澄清这些作用。
9.3 输入蛋白能调节组蛋白翻译后修饰（PTMs）吗？
组蛋白成熟过程中PTMs添加和去除的时间与顺序仍不清楚。鉴于输入蛋白在组蛋白进入细胞核前隔离它们，它们可能影响组蛋白对修饰酶（如HAT1/RbAP46）的可及性，从而充当协调PTM状态与核输入的调控检查点。
9.4 伴侣-组蛋白相互作用发生在哪里——细胞质还是细胞核？
一个基本未解决的问题涉及特定组蛋白-伴侣相互作用发生的细胞区室。当前的模型依赖于分级提取物的分析，这些方法容易受到核泄漏和交叉污染的影响。需要更精确的方法来绘制从组蛋白合成到沉积入核小体的伴侣事件序列。
