《British Journal of Haematology》：Plasma calprotectin to assess susceptibility to bloodstream infections during paediatric acute lymphoblastic leukaemia induction treatment
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本研究前瞻性评估了血浆钙卫蛋白（calprotectin）作为儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）诱导化疗期间血流感染（BSI）风险补充标志物的价值。研究发现，在标准化疗方案导致普遍中性粒细胞减少（ANC <0.5 × 109/L）的背景下，循环中性粒细胞绝对值（ANC）在BSI发生时无法区分高风险患者。而钙卫蛋白，作为一种反映全身（包括血管外）中性粒细胞总量的蛋白质，其降低水平（特别是在诱导治疗第8天）与后续BSI风险增加显著相关（OR 1.52）。这提示钙卫蛋白或能提供超越传统ANC的临床信息，为评估免疫功能抑制程度及指导抗菌策略提供新视角。
摘要
化疗诱导的中性粒细胞减少症，通过外周血中性粒细胞绝对值（ANC）监测，会增加血流感染（BSI）的风险。然而，ANC可能无法反映总中性粒细胞群，因为它忽略了血管外部位的中性粒细胞。因此，本研究评估了血浆钙卫蛋白，一种中性粒细胞来源的蛋白质，作为中性粒细胞减少症严重程度和BSI风险的补充标志物。
在114名根据NOPHO ALL2008方案治疗的急性淋巴细胞白血病（ALL）儿童中，在为期4周的以蒽环类药物为基础的诱导治疗期间每周测量血浆钙卫蛋白。每日的ANC和BSI事件从医疗记录中获取。所有患者均出现严重的中性粒细胞减少症（ANC <0.5 × 109/L）。在BSI发生时（中位第12天），有BSI的患者（n=29， 25%）和没有BSI的患者之间的ANC没有差异。尽管钙卫蛋白随ANC下降而下降，但相关性仅为中等（rs: 0.20–0.53， 所有p< 0.05）。经性别、年龄和风险组调整的多变量分析显示，在第1、8和15天，发生BSI患者的钙卫蛋白水平显著降低（所有p < 0.05）。钙卫蛋白每降低两倍，BSI风险增加的比值比（OR）为1.52 （1.07–2.15）， p= 0.018。总之，血浆钙卫蛋白降低与ALL诱导治疗期间的BSI相关，并且可能提供超越ANC的临床相关信息，以评估免疫抑制并指导抗菌策略。
引言
急性淋巴细胞白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，约占所有儿童癌症的25%。尽管总体预后良好且总生存率超过90%，但高强度的化疗方案由于严重的免疫抑制而构成重大风险，增加了严重感染和致命性脓毒症进展的风险。因此，国际指南建议对所有发热性中性粒细胞减少症发作进行经验性广谱抗生素治疗，尽管这些发作中只有大约一半最终归因于微生物学记录的感染，其中血流感染占大多数。
发热发作的临床解释因感染生物标志物（如C反应蛋白）也可能因化疗引起的组织损伤导致的非感染性全身炎症而升高而变得复杂。因此，一些患者可能接受了不必要的抗生素治疗，导致住院时间延长、化疗可能延迟、肠道微生物群破坏以及多重耐药细菌和医院感染风险增加。
在临床实践中，绝对中性粒细胞计数（ANC）通常基于循环中性粒细胞的浓度进行监测。然而，这种方法可能无法准确反映免疫能力，因为很大一部分中性粒细胞可能驻留在血管外，特别是在炎症或感染部位。因此，循环中性粒细胞水平检测不到并不能排除外周组织中存在活化的中性粒细胞。尽管长期中性粒细胞减少是公认的感染危险因素，但在ALL患者普遍性中性粒细胞减少期间，ANC的预测价值有限。因此，需要额外的策略来估计总中性粒细胞群及其活化状态，以改善ALL治疗期间的风险评估。
血液钙卫蛋白，也称为S100A8/A9和骨髓相关蛋白-8/14（MRP-8/14），主要由中性粒细胞表达，占其胞质蛋白的40%。在炎症发生时，钙卫蛋白激活Toll样受体4，触发促炎细胞因子释放，并通过增加血管通透性、刺激粘附分子表达和下调紧密连接蛋白来促进中性粒细胞募集。它还通过螯合二价阳离子（如钙、锌、铜、镁）来剥夺病原体的营养，从而表现出直接的抗菌作用。尽管存在严重的中性粒细胞减少，血浆中仍可检测到钙卫蛋白，这反映了外周组织中活化的中性粒细胞持续释放。然而，这种模式可能使免疫功能低下患者的解释复杂化，因为钙卫蛋白随着中性粒细胞计数因细胞来源减少而下降，但在炎症期间由于剩余的活化中性粒细胞释放增强而增加。
最近一项针对儿童造血干细胞移植（HSCT）的研究表明，钙卫蛋白水平在早期再生障碍期间是可检测的，并且在早期植入和严重炎症（如急性移植物抗宿主病）患者中升高，而较低水平则与中性粒细胞恢复延迟和BSI风险增加相关。钙卫蛋白升高也与炎症性疾病（如幼年特发性关节炎、川崎病和过敏性紫癜性肾炎）的疾病活动度相关。
在本研究中，我们检测了儿童ALL诱导治疗期间血浆钙卫蛋白水平，以研究中性粒细胞减少症患者钙卫蛋白水平降低是否表明更严重的免疫抑制，从而构成BSI风险增加。
材料与方法
研究人群
在2013年3月至2018年12月期间，共有114名诊断为ALL的儿童（1-18岁）在开始诱导治疗前被纳入。在这项丹麦多中心研究中，患者在哥本哈根国家医院、欧登塞大学医院或奥胡斯大学医院接受治疗。所有患者均根据北欧儿科血液学和肿瘤学会ALL2008方案进行治疗。该方案中29天的诱导治疗包括第1天和第22天静脉注射阿霉素，以及每日口服泼尼松龙（非高危）或地塞米松（高危）以及第1、8、15和29天静脉注射长春新碱和鞘内注射甲氨蝶呤。
十名年轻的成年献血者作为健康对照（20-31岁，50%女性）。
患者特征总结于表1。该研究人群先前已有描述。
血流感染
当主要因发热怀疑感染时，采集血培养作为临床管理的一部分。发热定义为单次体温测量≥38.5°C或体温≥38.0°C持续超过一小时。在开始静脉抗生素治疗前，从中心静脉导管采血。用于微生物鉴定的血培养由区域诊断医学生物学实验室进行，并在诱导治疗的29天内为本研究注册。BSI的定义是从血培养中分离出至少一种细菌或真菌病原体。常见的皮肤污染物，包括凝固酶阴性葡萄球菌、痤疮皮肤杆菌、微球菌属和棒状杆菌属（杰氏棒状杆菌和白喉棒状杆菌除外），除非在两个同时或在72小时内采集的血培养中鉴定出相同的物种和抗生素谱，否则不被视为BSI。如果同一种病原体在10天内在两个不同的血培养中被分离出来，则记录为单次BSI发作；如果同一血培养或同时采集的多个血培养中分离出两种或更多病原体，则视为多重微生物感染。
血浆钙卫蛋白定量
在诱导治疗期间，于第1天（n=107）、第8天（n=110）、第15天（n=106）、第22天（n=106）和第29天（n=105）（预定时间点±2天）每周采集EDTA抗凝血。血浆通过1000 g离心10分钟分离，并在采集后2小时内储存在-80°C。
钙卫蛋白水平通过酶联免疫吸附测定法定量。对于统计分析，所有低于检测限的值被任意设定为检测下限的四分之一。
C反应蛋白和绝对中性粒细胞计数
ANC和血浆CRP作为临床常规每日测量，并从患者的医疗记录中收集。如果每天有多次测量，则使用CRP的最高水平和最低ANC。中性粒细胞减少症定义为ANC <0.5 × 109细胞/L。ANC通过流式细胞术量化，但在总白细胞计数非常低的情况下，通过显微镜检查获得中性粒细胞的分类计数。CRP水平使用自动免疫比浊法进行分析。
统计学
使用具有非结构化协方差矩阵和时间作为固定效应的混合模型重复测量分析来分析钙卫蛋白和ANC（由于偏态分布，经log2转换后）随时间变化的配对比较，以及在固定时间点组间比较。使用逻辑回归分析来研究钙卫蛋白的预测价值。使用Spearman等级相关分析进行相关性分析以评估定量变量之间的关联。Fisher精确概率检验用于比较组间的分类结果。对于统计分析，所有低于检测限的ANC测量值被任意设定为0.05 × 109细胞/L。除非另有说明，数据以中位数和范围表示。双侧p值<0.05被认为具有统计学显著性。所有统计分析均使用SAS 9.4版进行。
伦理学
在纳入前获得了父母/法定监护人的书面和口头知情同意，该研究获得了当地科学伦理委员会的批准，并根据《赫尔辛基宣言》进行。
结果
血流感染
在诱导治疗期间，114名患者中有29名（25%）发生BSI，中位发病时间为第12天。只有四次发作发生在诱导治疗的第一周，大多数（n=24， 83%）在第2周和第3周内诊断。共鉴定出18种不同的病原体，总计32个阳性分离株。两名患者发生多重微生物感染。革兰氏阳性菌占所有菌种的21（66%），其中草绿色链球菌群最常见（12个分离株，占38%）。详细概述先前已有描述。
BSI的发生与性别、ALL表型、诱导方案类型或年龄无关。
绝对中性粒细胞计数
在开始抗肿瘤治疗前，113名患者中有57名（50%）患有中性粒细胞减少症（定义为ANC <0.5 × 109细胞/L），随后在诱导治疗的前几周，所有患者的ANC均出现深度下降。大约在第22天，患者在给予第二剂阿霉素之前普遍表现出ANC略有上升，随后是ANC的二次下降，然后大多数患者出现快速恢复。
在第一周，随后发生BSI的患者的ANC普遍较低，在诊断时点（化疗开始前）水平显著降低（p< 0.0001）。在诊断时患有中性粒细胞减少症的57名患者中，有25名（44%）在诱导治疗期间发生BSI，而在该时间点未患中性粒细胞减少症的56名患者中，只有4名（7%）发生BSI（比值比=9.95，p< 0.0001）。
然而，在化疗的随后几周，与BSI发生期重叠时，有和没有BSI的患者之间未发现ANC差异。然而，发生BSI的患者ANC恢复较慢，在第29天显示出显著低于无BSI患者的ANC（p= 0.0068）。
血浆钙卫蛋白
在诊断时（第1天），患者的钙卫蛋白中位水平与健康对照相比有升高趋势（0.73 μg/mL vs. 0.42 μg/mL， p= 0.062）。然而，开始化疗后，患者的钙卫蛋白逐渐下降，在第15天达到最低点，p< 0.0001。之后，钙卫蛋白逐渐增加，尽管在第29天与第1天相比仍然降低。患者在诱导治疗第15天的钙卫蛋白水平显著低于年轻健康对照（p= 0.017）。
在所有五个每周时间点均观察到钙卫蛋白水平与ANC之间存在中等但显著的正相关，在诊断时比化疗诱导的中性粒细胞减少症期间更明显：第1天（rs= 0.53， p< 0.0001），第8天（rs= 0.46， p< 0.0001），第15天（rs= 0.26， p= 0.007），第22天（rs= 0.43， p< 0.0001），第29天（rs= 0.20， p= 0.04）。
在多变量混合模型重复测量分析中，经性别、年龄和风险组调整后，发生BSI的患者在整个诱导治疗期间的钙卫蛋白水平均低于无BSI患者，在第1、8和15天达到显著性。在多变量逻辑回归里程碑分析中，经上述变量调整后，第8天钙卫蛋白降低与随后发生BSI的风险增加相关（OR：每降低两倍为1.52；95% 置信区间：1.07–2.15；p= 0.018）。
钙卫蛋白与ANC比值及C反应蛋白
由于观察期间骨髓抑制程度不同，计算了钙卫蛋白与ANC的比值作为中性粒细胞活化的额外衡量指标。发生BSI的患者在第29天的比值增加（2.91 μg/106细胞 vs. 0.87 μg/106细胞，p= 0.043），但在其他时间点没有差异。
发生BSI的患者比无BSI患者表现出更高的CRP水平，尽管这种差异仅在BSI诊断中位时间点之后才具有统计学意义。在第1天和第8天未观察到差异。当相对于BSI发病日（血培养阳性采集日）分析CRP水平时，在血培养阳性后1-2天首次检测到增加。
在诱导治疗的所有评估时间点，钙卫蛋白-ANC比值与CRP均呈正相关；第1天（rs= 0.34， p= 0.0003），第8天（rs= 0.2， p= 0.041），第15天（rs= 0.3， p= 0.0025），第22天（rs= 0.55， p< 0.0001），第29天（rs= 0.51， p< 0.0001）。然而，钙卫蛋白-ANC比值与BSI风险无关。
讨论
本研究调查了血浆钙卫蛋白作为ALL儿童中性粒细胞减少症的补充衡量指标，其基础在于仅在外周血中测量的ANC可能无法反映总中性粒细胞群，而总中性粒细胞群很大一部分驻留在血管外组织中。这种局限性在炎症期间尤其相关，此时中性粒细胞被募集到受影响部位，进一步降低了ANC作为总中性粒细胞群衡量指标的可靠性。目前，没有临床既定的方法来评估跨血管内和血管外腔室的总中性粒细胞群。
在该队列中，所有患者在诱导阶段均出现严重的中性粒细胞减少症，在第1周至第3周期间ANC水平几乎无法测量，这与BSI发生的中位时间点重合。尽管在诊断时因白血病诱导的骨髓抑制而患有中性粒细胞减少症的患者在诱导治疗期间发生BSI的风险显著更高，但我们发现在化疗第一周后，发生BSI和未发生BSI的患者之间ANC没有明显差异。
尽管钙卫蛋白水平的总体模式似乎与ANC的模式相似，但在化疗诱导的中性粒细胞减少症阶段，钙卫蛋白与ANC之间的相关性普遍较弱，且钙卫蛋白水平的变异性较大。
具有潜在重要性的是，在治疗的前两周，在化疗过程中发生BSI的患者中发现钙卫蛋白水平显著降低，表明这些患者与未发生BSI的患者相比，中性粒细胞减少症更为严重。这些发现与之前一项研究钙卫蛋白作为异基因干细胞移植期间中性粒细胞恢复延迟标志物的研究结果一致。
ANC和钙卫蛋白水平之间的弱相关性可能反映了炎症期间中性粒细胞外渗的可变性。在这些部位，外渗的中性粒细胞释放钙卫蛋白，钙卫蛋白可以逐渐渗入循环，从而即使在外周血计数降至可测量水平以下时也能间接检测到存活的中性粒细胞。此外，严重炎症可能诱导活化的中性粒细胞分泌更多的钙卫蛋白，这也可以从观察到的血浆CRP与钙卫蛋白对ANC比值之间的正相关性中得到证实。事实上，这可能导致本研究通过钙卫蛋白测量的BSI患者中性粒细胞减少程度被低估。
尽管如此，我们的研究结果表明，钙卫蛋白可以作为评估中性粒细胞减少程度的有价值标志物，并提供比ANC和CRP更详细的信息，因为后两者无法在诊断前识别BSI患者，而CRP仅在发病后才升高。因此，钙卫蛋白水平可用于风险评估，以识别可能受益于更密切观察甚至抗生素预防的患者，而抗生素预防在儿童中并非常规推荐。
此外，钙卫蛋白有可能用于确定持续的中性粒细胞减少症是由于中性粒细胞迁移或消耗增加所致，还是由于骨髓生成受损引起的中性粒细胞减少症。需要进一步的研究来探索这方面。
这项前瞻性多中心研究的主要优势包括患者数量相对较多，以及按预定时间表进行的全面连续血浆采样。患者队列在诊断和治疗方案方面是同质的。局限性包括测量时间相对于BSI发生和中性粒细胞减少症高峰的时间安排。特别是第8天和第15天之间每日测量钙卫蛋白，以及持续测量钙卫蛋白直到后续治疗块的预定时间，将为评估诊断和预测应用提供更坚实的基础。由于本研究并非旨在正式评估诊断准确性，关于钙卫蛋白联合ANC的诊断或预测性能的结论应在未来专门为此目的设计的研究中解决，并纳入外部验证队列。此外，本研究未包括降钙素原（PCT）测量，PCT在临床实践中正受到关注，可能为早期BSI检测提供补充信息。尽管如此，考虑钙卫蛋白水平的模糊性质带来的挑战是重要的，它同时反映了中性粒细胞的总数和活化程度。
总之，本研究提示钙卫蛋白值得作为严重免疫抑制期间的一种补充标志物进行进一步评估，从而能够更准确地评估中性粒细胞减少症。当与其他生化和临床参数整合时，它可能有助于在症状出现前识别感染风险增加的患者，从而能够进行有针对性的支持性干预，例如抗生素预防，并可能因此降低感染发病率和广谱抗生素的不必要使用。此外，钙卫蛋白可能有助于区分患有持续性中性粒细胞减少症的患者与具有活化和迁移的中性粒细胞的患者，这对安排后续抗肿瘤治疗块的时间具有重要影响。这些发现值得在前瞻性临床试验中进行研究。
