《Transboundary and Emerging Diseases》：Comparative Evaluation of ELISA Tests for Bovine Tuberculosis Detection: Implications for Improved Disease Control
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本文综述比较评估了两种用于检测牛结核病（bTB）的间接酶联免疫吸附试验（ELISA），一种基于MPB70、MPB83和ESAT-6蛋白片段的实验性嵌合抗原，另一种是已获世界动物卫生组织（WOAH）注册的商业化试剂盒。研究发现，与传统的比较颈部皮内结核菌素试验（CCITT）相比，两种ELISA均能检出更多感染动物，提示其可作为现有诊断工具的重要补充，以提升在地方性流行区域的监测与根除策略效能。
引言
牛结核病（bTB）是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种慢性人畜共患病，在全球范围内对畜牧业、野生动物和人类健康构成重大威胁。该病导致生产力下降、胴体废弃、贸易受限以及高昂的检测和扑杀成本，造成巨大的经济损失。在巴西，国家牛结核病控制和根除计划（PNCEBT）主要采用基于比较颈部皮内结核菌素试验（CCITT）的“检测-扑杀”策略。CCITT检测的是感染早期占主导的细胞介导免疫（CMI）反应，但其敏感性有限，尤其在感染后期。因此，寻求基于抗体检测的补充性诊断工具，如酶联免疫吸附试验（ELISA），对于提高病例检出率、完善疫病控制方案具有重要意义。
本研究旨在对两种间接ELISA进行对比评估：一种是处于实验阶段、使用由MPB70、MPB83和ESAT-6蛋白片段组成的嵌合抗原的ELISA；另一种是基于MPB70和MPB83抗原、已在WOAH注册的商业化ELISA。评估在南巴西已知bTB流行病学史的牛群中进行，血清样本来自147头牛，所有动物均接受了CCITT检测，部分动物还进行了宰后检验、细菌培养和巢式PCR。本研究结果旨在阐明每种血清学方法的潜在优势与局限。
材料与方法
研究设计在巴西南里奥格兰德州的21个养牛场进行横断面调查，最终对来自9个牛群的147头屠宰牛进行了分析。这些牛群具有不同的感染史和官方bTB认证状态。
主要诊断方法：
- 1.
CCITT：由PNCEBT授权兽医执行，使用牛源和禽源纯化蛋白衍生物（PPD）。结果根据注射部位皮肤厚度差（Δ）判定：Δ >4.0 mm为阳性；Δ在2.0-4.0 mm之间为可疑；Δ <2.0 mm为阴性。分析时将可疑动物视为阴性，除非连续两次可疑则重新归类为阳性。
- 2.
商业化ELISA：使用IDEXX M. bovis抗体检测试剂盒，按说明书操作，结果以样本/阳性（S/P）比值表示。
- 3.
实验性间接ELISA：使用包含ESAT-6、MPB70和MPB83亲水结构域的嵌合抗原进行。结果同样以S/P比值表示，阳性临界值通过散点图进行牛群特异性确定。
- 4.
宰后确认：收集包括淋巴结在内的组织样本，进行肉眼病变检查、细菌培养和巢式PCR，以确认牛分枝杆菌感染。
数据分析：使用ROC曲线评估诊断性能，计算灵敏度、特异性、曲线下面积（AUC）和约登指数。通过列联表计算表观流行率、真实流行率、Kappa一致性指数、McNemar检验和比值比（OR）。根据个体检测结果确定牛群水平的bTB状态。
结果
牛群背景：根据CCITT结果和感染史，21个牛群被分为五类流行病学类别：未认证无感染史（A-C）、认证无疫无感染史（D-F）、认证无疫有感染史（G-I）、CCITT阴性有感染史（J-K）、CCITT阳性并经PCR确认（L-U）。一个值得注意的案例是牛群L，一头CCITT反复呈可疑的动物经PCR确认为感染。
探索性分析与ELISA结果：ROC曲线分析显示，两种ELISA与CCITT作为参考标准相比，阳性和阴性群体重叠显著，导致灵敏度和特异性均较低（实验性ELISA的约登指数=0.1620；一致性指数=0.1136）。当使用统一的0.300 S/P临界值时，实验性ELISA检出16.6%的动物为血清阳性，商业化ELISA检出13.0%，均高于CCITT检测出的4.4%的表观流行率。
按牛群绘制的ELISA结果箱线图显示，实验性ELISA的结果离散度更广。除牛群J外，所有牛群至少有一头动物的实验性ELISA结果超过0.300的临界值。而商业化ELISA在牛群A、G、J和Q中未检出阳性。值得注意的是，牛群Q此前有CCITT阳性结果并经组织病理学确认病例，但按商业化临界值却被归类为阴性，这表明商业化检测在田间场景中可能存在低估流行率的风险。
散点图比较了按牛群分组的ELISA结果，揭示了结果的一致性与分歧模式。在未认证牛群（A-C）中，实验性ELISA采用略低于0.300的临界值可将牛群A中的个体判为阳性。在认证无疫牛群（D-F和G-I）中，商业化ELISA比在未认证牛群中检出了更多阳性，但牛群G例外（商业化ELISA为阴性，但有动物接近临界值且有已知感染史）。在CCITT阴性但有感染史的牛群（J和K）中，实验性ELISA在牛群K中检出了阳性，但在牛群J中未检出。
流行率与一致性：将牛群阳性定义为至少有一头动物在0.300临界值下呈阳性，则实验性ELISA在21个牛群中检出20个阳性（95.2%），商业化ELISA检出17个（80.9%），而CCITT仅检出9个（42.8%）。只有牛群J在两种ELISA下均为阴性。在全部六个认证无疫牛群中，两种ELISA均发现了血清阳性动物。
与CCITT相比，两种ELISA的Kappa一致性均很低：实验性ELISA与商业化ELISA之间为4.60%，商业化ELISA与CCITT之间为-2.16%，实验性ELISA与CCITT之间为12.55%。相对于CCITT，实验性和商业化ELISA的灵敏度分别为28.81%和9.32%，特异性分别为82.59%和86.38%。
当与宰后病变以及培养和/或巢式PCR确认结果比较时，实验性ELISA对病变的灵敏度为29.17%，特异性为80.81%；对培养/PCR的灵敏度为23.26%，特异性为84.81%。商业化ELISA对病变的灵敏度为13.33%，特异性为91.18%；对培养/PCR的灵敏度仅为6.98%，但特异性高达97.47%。
讨论
本研究在多个bTB认证无疫牛群中使用两种ELISA均观察到意外高的血清阳性率。一种假说认为这可能是由于反复的皮内结核菌素（PPD）测试导致的致敏反应。然而，文献表明在真正无结核的动物中，PPD致敏并不会引起假阳性血清学反应。牛群I虽然每年进行PPD测试且在2年前经历更密集的检测，但其高血清阳性率更可能与残留或持续感染一致，而非仅由PPD致敏引起。相反，牛群A和M近期未进行皮肤测试，ELISA反应性很低或没有。这些观察结果支持感染是驱动高血清阳性率的主要因素。
在CCITT仍作为bTB特异性检测方法的同时，其在晚期感染中的敏感性会下降，这限制了其作为验证抗体检测方法的唯一参考标准的价值。血清学检测捕获的是互补的免疫反应，因此针对不同的感染阶段。实验性ELISA包含ESAT-6以及MPB70和MPB83，可能增强对早期或活动性感染阶段的检测，而缺乏ESAT-6的商业化ELISA可能更好地识别慢性或既往暴露的动物。这种抗原组成的差异很可能导致了实验性ELISA在感染牛群中更高的阳性率以及可变异的特异性。
此外，抗原特异性抗体应答的时间动态也需考虑：MPB83和ESAT-6抗体倾向于在感染后较早出现，而MPB70抗体出现较晚。基于不同抗原谱的ELISA因此将捕获不同亚组的感染动物，这部分解释了实验性ELISA在检测被CCITT遗漏动物方面的优越敏感性。
与先前报告更高ELISA灵敏度和特异性的研究相比，本研究对自然感染牛群进行了抽样，未人为富集感染个体。这种现实世界的抽样可能导致血清学应答的更广泛变异，反映了异质的感染阶段、牛群管理以及宿主-病原体-环境相互作用。
对ELISA诊断性能的精确评估受到缺乏真正金标准、屠宰动物抽样不均以及培养和PCR的不完美敏感性等因素的限制。特别是在低流行率牛群中，标准的ROC和频率学度量可能错误表征检测价值。因此，将血清学数据与流行病学和历史牛群信息相结合的综合性解释框架至关重要。
结论
总之，血清学检测，特别是具有广泛抗原覆盖度的实验性ELISA，通过检测可能被细胞免疫测试遗漏的动物，为CCITT提供了有用的补充。然而，由于检测间一致性极低，且灵敏度和特异性的问题尚未完全解决，ELISA尚不应取代传统诊断方法或单独用于流行率调查或认证程序。其作用更适合被设想为在综合性根除策略中作为平行的辅助检测工具。
