《Scientific Reports》：Bladder organoid conditioned media enhances myoblast proliferation under serum free conditions
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为了开发不依赖胎牛血清(FBS)的培养基质用于培养肉生产，研究人员评估了多种小鼠器官(肺、胆囊、脾、肾、膀胱)来源的类器官条件培养基对成肌细胞增殖的效应。其中，小鼠膀胱类器官上清(MBOS)对小鼠C2C12成肌细胞系和牛原代成肌细胞的增殖促进效果最为显著。研究表明，MBOS通过上调细胞周期相关基因CCNB1和CDK1、增加G2/M期细胞比例来驱动细胞增殖，其效应不依赖于其中富集的胰岛素样生长因子(IGF)-1。该研究为开发可持续的、无血清的培养肉生产技术提供了一种新的、有前景的候选方案。
随着全球人口增长和对可持续蛋白质需求的提升，培养肉技术作为传统畜牧业的一种潜在替代方案，正受到越来越多的关注。它有望减少温室气体排放、节约土地和水资源，并避免与动物屠宰相关的伦理问题。然而，这项技术走向规模化生产仍面临重大挑战，其中最关键的一点是寻找胎牛血清(FBS)的替代品。胎牛血清是目前细胞培养中广泛使用的生长因子来源，但其存在批次间成分差异大、潜在病原体污染风险、伦理争议以及高昂的环境成本等缺陷，使得它难以应用于食品级的培养肉生产。因此，开发高效、稳定、可持续的无血清培养基已成为该领域亟待解决的核心问题。
为了应对这一挑战，研究人员将目光投向了类器官这一前沿技术。类器官是由干细胞分化形成的三维细胞团，能够模拟真实器官的结构和功能。在培养过程中，类器官会分泌多种生长因子、细胞因子和细胞外基质成分到培养上清中，形成所谓的“条件培养基”。研究人员推测，这种由类器官自然分泌的、复杂的生物活性分子混合物，或许可以替代胎牛血清，为肌肉细胞的生长提供必要的信号支持。发表在《Scientific Reports》上的这项研究，系统地探索了这一设想。
研究人员采用了包括类器官培养与表征、条件培养基制备、细胞增殖与活力检测、RNA测序(RNA-seq)与生物信息学分析、实时定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、流式细胞术细胞周期分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及原代细胞培养与免疫荧光染色在内的多种关键技术方法。研究样本来源于5周龄雄性C57BL/6J小鼠的多个器官以及处于生产周期末期的牛的骨骼肌组织。
生成源自小鼠肺、胆囊、脾、肾和膀胱组织的类器官
研究人员成功从小鼠肺、胆囊、脾、肾和膀胱组织中分离细胞，并培养出具有三维结构的类器官。通过苏木精-伊红(H&E)染色和免疫组织化学(IHC)染色，确认了这些类器官表达各自组织的特异性标志物，例如肺类器官表达甲状腺转录因子(TTF)-1，膀胱类器官表达细胞角蛋白(CK)5和尿路上皮特异性蛋白(UPK)3A，证明了其组织身份和上皮特性。
五种小鼠类器官条件培养基对C2C12细胞生长的影响
将五种器官（肺、胆囊、脾、肾、膀胱）类器官的培养上清与基础培养基混合，制备成条件培养基，用于培养小鼠C2C12成肌细胞。在无血清条件下，所有类型的条件培养基均能促进C2C12细胞增殖，其中源自膀胱类器官的条件培养基(MBOS)效果最为显著，其促增殖能力与含10%胎牛血清的培养基相当。
MBOS促进C2C12细胞生长的机制
为了探究MBOS的作用机制，研究人员对经MBOS处理的C2C12细胞进行了RNA测序分析。结果显示，与未处理的对照组相比，MBOS处理导致了2714个基因的显著差异表达。基因集富集分析(GSEA)发现，MBOS处理显著富集了与细胞周期相关的通路，特别是“E2F靶标”和“G2/M检查点”通路。其中，细胞周期蛋白B1(CCNB1)和细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)的mRNA和蛋白表达水平均被MBOS显著上调。进一步的流式细胞术分析证实，MBOS处理使处于G2/M期的细胞比例显著增加，表明MBOS通过促进细胞周期进程来驱动细胞增殖。
MBOS中生长因子对C2C12细胞增殖的影响
通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测发现，MBOS中胰岛素样生长因子(IGF)-1的浓度显著高于对照组，而IGF-2的浓度没有变化。然而，当在MBOS培养基中加入中和性的IGF-1抗体后，C2C12细胞的增殖并未受到显著抑制。这一结果表明，MBOS的促增殖效应并非仅由IGF-1介导，很可能涉及其他因子或更复杂的信号网络。
MBOS对牛肌肉来源原代成肌细胞增殖的影响
为了验证MBOS的跨物种应用潜力，研究人员从牛骨骼肌中分离出原代成肌细胞，并确认其表达成肌标志物肌源性因子(Myf)5和成肌分化蛋白(MyoD)。细胞计数分析显示，与无血清对照组相比，MBOS处理显著增加了牛原代成肌细胞的数量，证明其促增殖作用同样适用于食品相关物种的细胞。
本研究的主要结论是，成功开发了一种源自小鼠膀胱类器官的条件培养基(MBOS)，它能在无血清条件下有效促进小鼠和牛来源的成肌细胞增殖。其作用机制涉及上调关键细胞周期调节因子CCNB1和CDK1，从而驱动更多细胞进入G2/M期。尽管MBOS中含有较高水平的IGF-1，但其促增殖效应不依赖于单一的IGF-1信号，提示其中含有尚未鉴定的其他重要生物活性成分。这项研究的意义在于，它为培养肉生产提供了一种新颖的、基于类器官分泌组的FBS替代策略。与单一生长因子或化学限定培养基相比，类器官条件培养基模拟了更接近生理环境的复杂信号组合，可能更有利于细胞的长期健康和功能。尽管目前使用的是小鼠模型，且培养体系中可能含有痕量的动物源性成分残留，但这项概念验证研究为未来开发完全无动物成分、可扩展的培养肉生产培养基奠定了重要的基础。未来的研究可以聚焦于解析MBOS的详细蛋白质组学构成，优化类器官培养条件以提高分泌效率，并将该策略应用于更多食用动物物种的类器官系统，最终推动培养肉技术向商业化、可持续化方向发展。
