《Influenza and Other Respiratory Viruses》：A Monoclonal Antibody ELISA–Based Assay for Measuring the Potency of Candidate H5 Clade 2.3.4.4b Pandemic Influenza Vaccines
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本文是一项方法学研究，旨在建立一种基于单克隆抗体(mAb)的ELISA（酶联免疫吸附测定）效价检测方法，以替代传统的单径向免疫扩散(SRID)法，用于评估针对H5N1（分支2.3.4.4b）病毒株A/Astrakhan/3212/2020的灭活流感疫苗的效力。研究表明，利用早在当前病毒出现前数年制备的H5 mAb库，可以快速开发出高相关性、高灵敏度的替代效价测定方法，为应对突发流感大流行提供了关键的快速检测工具储备策略。
引言
单径向免疫扩散(SRID)测定法自1978年以来一直是测量灭活流感疫苗效价的标准方法。尽管其实用性强，但仍需开发具有更高灵敏度且更少依赖大量参考试剂的替代性流感疫苗效价测定法。许多候选替代效价测定法使用单克隆抗体(mAb)来量化疫苗中相关的免疫原性血凝素(HA)形式。然而，人们仍然担忧能否在疫苗生产所需的时间框架内（尤其是针对大流行疫苗）产生必要的抗体试剂。本研究描述了基于mAb的ELISA测定法的开发与评估，用于测量为应对美国当前H5N1疫情而制备的几种候选H5分支2.3.4.4b A/Astrakhan/3212/2020流感疫苗的效价。该测定法使用了在这些H5N1病毒出现前数年就已产生并鉴定的H5 mAbs。
结果
2.1 A/Astrakhan/3212/2020疫苗的SRID效价
本研究中，使用标准参考抗体试剂和一种替代效价抗体试剂，通过SRID测定了三种疫苗（一种细胞基质疫苗A和两种鸡胚基质疫苗B、C）的效价。结果显示，对于每种疫苗，使用标准抗体试剂与使用替代抗体试剂测得的效价无统计学差异，最终为疫苗A、B、C分别指定了18.8、31.1和34.0 μg/mL的SRID效价值。疫苗A和B的结果与先前报告相似。
2.2 细胞基质H5流感A/Astrakhan/3212/2020疫苗的mAb捕获ELISA效价测定法的开发
研究测试了一组针对H5分支2.3.4.4c A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014病毒HA制备的mAb以及一个交叉反应性H5 mAb 5C2。所有测试的H5 mAb都能很好地结合细胞基质参考抗原。在mAb捕获-多克隆抗体检测的ELISA标准格式下，评估了这些H5 mAb作为捕获抗体的能力。使用mAb 3H4和8D1获得的效价值分别为19.4 ± 1.2和20.5 ± 0.2 μg/mL，与SRID测定的18.8 μg/mL效价值相差在10%以内，而使用交叉反应性H5 mAb 5C2得到的结果与SRID值差异最大。因此，选择H5 mAbs 3H4和8D1进行进一步的测定法开发和评估。
研究还通过改变ELISA测定中的其他参数来确定疫苗A的效价，包括评估使用针对较早的H5分支2.3.4.4c A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014 HA制备的多克隆抗体，以及使用多克隆抗体捕获、mAb 3H4或8D1作为检测抗体的ELISA格式。结果显示，使用多克隆抗体捕获、mAb检测的格式也产生了可接受的效价值，均与SRID值相差在20%以内。
此外，研究评估了3H4和8D1检测因压力导致效价损失的能力。在56°C下对细胞基质H5流感A/Astrakhan疫苗进行热处理会导致SRID效价快速下降。而使用3H4和8D1的ELISA效价测定能够量化热处理样品中降低的效价，并显示随着热处理时间的延长，效价持续下降，证实了mAb捕获ELISA对HA完整性丧失具有敏感性。
综上所述，使用H5 mAbs 3H4和8D1、以多克隆兔AS-ED IgG作为检测抗体的mAb捕获ELISA，是细胞基质H5流感A/Astrakhan疫苗可接受的替代效价测定方法，同时结果表明测定法的设计和格式具有一定灵活性。
2.3 鸡胚基质H5流感A/Astrakhan/3212/2020疫苗的mAb捕获ELISA效价测定法的开发
进一步研究评估了H5 mAbs 3H4和8D1在抗体捕获ELISA中测定鸡胚基质A/Astrakhan疫苗效价的能力。两种mAb都能很好地结合鸡胚基质参考抗原。使用这两种mAb作为捕获抗体、A/Astrakhan多克隆IgG作为检测抗体的基本测定格式，测定了来自两家制造商的两种鸡胚基质A/Astrakhan疫苗的效价。对于疫苗B，使用任一捕获mAb的ELISA效价结果与SRID效价结果具有良好的一致性，ELISA效价值与SRID效价值相差在2%以内，表明mAb捕获ELISA是该疫苗可接受的替代效价测定法。而对于疫苗C，ELISA和SRID的效价值最初并未很好地对齐，相差约30%。
作为大量测定优化的替代方案，研究探讨了使用经校准的内部标准品。当将60 μg/mL配方的疫苗C设置为其SRID值并用作内部参考时，30 μg/mL疫苗C的ELISA效价值与SRID测定效价的差异小于15%。同样，当使用15 μg/mL疫苗作为内部参考时，30 μg/mL疫苗C的ELISA效价值与SRID值的差异在2%以内。这些结果表明，通过建立与SRID相关联的内部参考标准，即使在初始结果未达到可接受的一致性时，mAb捕获ELISA也可用于H5鸡胚基质疫苗的效价测定。
讨论
自2009年H1N1大流行以来，开发流感疫苗替代效价测定法的努力不断加强。这主要是因为传统SRID效价测定的试剂制备耗时，且制造商和监管机构所需的试剂数量巨大。此后，各种制造商、监管机构和研究所开发并评估了众多作为SRID潜在替代方案的测定法。
替代性流感疫苗效价测定法可分为非抗体基方法和抗体基方法。非抗体基方法包括高效液相色谱、同位素稀释质谱和表面等离子体共振等物理化学方法。这些方法本身通常缺乏仅量化样品中构象和抗原性正确的HA的能力。抗体基方法作为替代疫苗效价测定法具有吸引力，因为它们能够区分和量化疫苗样品中相关的免疫原性HA形式。
本研究的主要目标是探索针对H5N8病毒A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014（分支2.3.4.4c）HA制备的一组H5 mAb，是否可用于开发针对A/Astrakhan/3212/2020（分支2.3.4.4b）疫苗的ELISA效价测定法。所有四种2.3.4.4c mAb和交叉中和性2.3.2.1a mAb都能够在效价ELISA中捕获和量化HA，但不同mAb产生的效价结果与SRID值的吻合程度存在差异。使用mAbs 3H4和8D1获得的ELISA效价结果与细胞基质疫苗A的指定SRID效价值最为接近，因此被选择用于扩展分析。
对于疫苗A和B，ELISA效价测定结果与其相对的SRID效价值吻合良好，差异小于10%，表明本文描述的mAb捕获ELISA测定法可用于这些疫苗的效价测定，几乎不需要额外的优化。对于疫苗C，捕获ELISA结果与SRID效价值之间的差异约为30%。虽然在某些情况下这种差异可能是可以接受的，但结果表明针对该疫苗需要进行额外的优化。使用其他疫苗配方作为模型，研究表明，建立与参考抗原直接校准的制造商特异性内部标准可能是另一种可接受的替代方案。
总体而言，本研究有几个关键要点。首先，所描述的mAb捕获ELISA是一种可接受的效价测定法，对于为应对美国H5N1分支2.3.4.4b病毒爆发而制造的候选灭活A/Astrakhan/3212/2020疫苗，仅需极少或适度的额外优化。其次，测定中使用的mAbs在当前流行的2.3.4.4b病毒出现之前就已可用，这为以下前提提供了额外支持：如果维持一个足够大且多样化的流感mAb库，那么mAb的可用性可能不会成为ELISA效价测定法的限制因素。第三，本研究中ELISA测定使用的多克隆抗体可以作为试剂库的一部分提前制备。第四，ELISA测定中使用的mAb和多克隆抗体均不需要活流感病毒。第五，与SRID相比，使用ELISA作为大流行流感疫苗的效价测定法减少了制造商所需的校准试剂量。
综合来看，当前研究的结果对于开发大流行流感疫苗的替代效价测定法是令人鼓舞的。然而，在此类替代测定法即使在紧急情况下也能实施之前，还需要进行额外的工作。正如已经指出的，mAb试剂的选择标准需要进一步明确。还需要建立机制以确保此类抗体试剂库的及时更新，并生产支持疫苗生产所需数量的抗体试剂。最后，尽管本研究未涉及，但开发一种独立于疫苗生产工艺、可用于所有类型灭活疫苗（例如鸡胚基质、细胞基质和重组）的参考抗原的替代生产方法，将是有利于加速大流行流感疫苗效价测定法开发和生产的改进措施。
材料与方法
4.1 疫苗
通过与美国卫生与公众服务部(HHS)下属的战略准备与响应管理局(ASPR)和生物医学高级研究与发展管理局(BARDA)的合同，由美国持证疫苗制造商生产了针对H5N8候选疫苗病毒A/Astrakhan/3212/2020的灭活流感疫苗。
4.2 流感H5单克隆抗体
针对H5分支2.3.2.1 H5N1 A/duck/Bangladesh/19097/2013和分支2.3.4.4c H5N8 A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014血凝素的鼠源mAbs如前所述。
4.3 流感H5多克隆抗体
针对H5N8 A/Astrakhan/3212/2020或A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014胞外域的多克隆IgG抗体按先前描述的方法制备。
4.4 通过单径向免疫扩散(SRID)测量效价
SRID测定基于去污剂裂解的病毒或抗原扩散到含有抗原特异性流感HA抗体的琼脂糖凝胶中，并如前所述进行。使用参考和测试疫苗的剂量反应曲线（抗原稀释度的对数与扩散环直径的对数），通过平行线生物测定法确定疫苗效价。
4.5 通过抗体ELISA测量效价
4.5.1 mAb捕获-多克隆检测
使用鼠源mAb包被微孔板，然后用含胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)封闭。参考抗原和疫苗样品用去污剂Zwittergent 3-14处理并稀释后加入板中孵育。洗板后，加入流感H5多克隆抗体，随后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。最后加入ABTS底物显色，通过酶标仪读取吸光度(A450)。HA浓度通过测试疫苗样品与参考抗原标准的四参数回归拟合的平行线分析确定。
4.5.2 多克隆抗体捕获-mAb检测
测定步骤与上述相似，区别在于使用H5多克隆抗体包被微孔板，并使用鼠源mAb进行检测，最后用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG进行显色。
4.6 统计分析
使用统计t检验比较测试疫苗之间效价值的差异，p值<0.05被认为具有统计学显著性。
