《IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY》：Treg cells retain stable lineage commitment during pregnancy in mice after late gestation inflammatory challenge
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本文利用Foxp3命运示踪小鼠模型，研究了在脂多糖（LPS）或白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的妊娠晚期炎症性早产模型中，调节性T（Treg）细胞的谱系稳定性。研究发现，无论在正常妊娠还是早产炎性模型中，子宫引流淋巴结中的Treg细胞都表现出高度的谱系稳定性，并未出现Foxp3表达丢失（即ex-Foxp3细胞）群体的扩增。该研究为理解Treg细胞在维持妊娠免疫耐受中的关键角色提供了新证据，并表明Treg细胞谱系失稳可能不是早产的主要驱动因素。
引言
早产是常见的妊娠并发症，也是导致儿童死亡的主要原因，而炎症是其主要的驱动因素。调节性T（Treg）细胞对于建立母胎免疫耐受和抑制子宫炎症至关重要。在其他组织环境中，Foxp3表达的缺失会导致Treg细胞谱系稳定性丧失、促炎细胞因子产生增加和抑制功能受损。然而，早产易感性是否与Treg细胞的谱系保真度丧失和促炎表型的获得有关尚不清楚。本研究利用Foxp3命运示踪系统，在脂多糖（LPS）或白细胞介-1β（IL-1β）诱导的小鼠妊娠晚期炎症性早产模型中，探究了Treg细胞的体内谱系稳定性。
结果
妊娠晚期系统性IL-1β给药增加了Treg细胞中Th17相关分子的表达
首先，研究人员利用妊娠晚期腹腔注射IL-1β诱导早产的小鼠模型（补充图S1和S2），考察了炎症刺激对子宫引流淋巴结（udLN）中Treg细胞的影响。IL-1β处理后24小时（妊娠第16.5天），udLN中CD4+T细胞总数和Foxp3+Treg细胞绝对数量均增加。进一步分析发现，尽管表达Th17相关转录因子RORγt或细胞因子IL-17A的Foxp3+细胞比例没有改变，但其绝对数量因总Treg细胞增加而增多。更重要的是，IL-1β处理后，IL-17A+和CCR6+Treg细胞的平均荧光强度（MFI）均显著升高，表明这些细胞表达的IL-17A和CCR6水平增加。这些发现提示，促炎环境可增强部分Treg细胞的Th17特征，但其是否意味着谱系转变尚需验证。
ex-Foxp3细胞存在于整个妊娠期，且主要为Nrp1?细胞
为了直接探究Treg细胞是否在妊娠期间丢失Foxp3，研究人员使用了Foxp3命运示踪小鼠模型。在该模型中，曾表达Foxp3的细胞会被永久标记为RFP+，而当前表达Foxp3的细胞则同时表达GFP和RFP。因此，GFP+RFP+代表Treg细胞，而RFP+GFP?细胞代表曾表达Foxp3的细胞，即ex-Foxp3细胞。研究发现，无论是在未孕小鼠还是孕早期（GD4.5）、孕中晚期（GD16.5）和孕晚期（GD18.5）小鼠的udLN中，都存在一个较小比例的ex-Foxp3细胞群体（约占CD4+T细胞的3.6%），且其比例和数量在整个妊娠期保持不变。脾脏中也观察到类似稳定的ex-Foxp3细胞群体。进一步分析显示，与Treg细胞相比，udLN和脾脏中ex-Foxp3细胞中表达Nrp1（胸腺来源Treg细胞标志物）的比例更低，更多是Nrp1?细胞（约占52-62%），这与它们可能来源于不稳定的外周诱导Treg细胞或短暂激活的常规T细胞的推论一致。值得注意的是，到妊娠晚期（GD18.5），udLN中ex-Foxp3细胞与Treg细胞的比值相较于孕早期（GD4.5）显著下降，这提示Treg细胞在妊娠晚期并未变得更加不稳定，反而可能趋于稳定。
ex-Foxp3细胞在妊娠期间维持促炎细胞因子的表达
研究人员进一步检测了ex-Foxp3细胞表达促炎细胞因子的能力。结果显示，与非妊娠和孕早期相比，udLN中Treg细胞表达干扰素-γ（IFNγ）或IL-17A的比例很低（均<3.1%），且在妊娠过程中没有显著增加。相比之下，ex-Foxp3细胞中表达IFNγ或IL-17A的比例显著高于同期的Treg细胞。例如，在孕早期（GD4.5），udLN中ex-Foxp3细胞表达IFNγ的比例是Treg细胞的19.1倍，表达IL-17A的比例是Treg细胞的14.8倍。这些数据表明，ex-Foxp3细胞是一个富集了促炎细胞因子表达的独特群体，但它们的这种特性在正常妊娠过程中并未随着妊娠进展而增强。
ex-Foxp3细胞不表达经典的Treg细胞谱系转录程序
为了深入解析ex-Foxp3细胞的身份，研究人员对来自孕晚期（GD18.5）udLN的Treg细胞和ex-Foxp3细胞进行了RNA测序分析。主成分分析显示，两种细胞群在转录组层面存在显著差异。差异表达基因分析发现，共有418个基因的表达量变化超过2倍，其中284个基因在ex-Foxp3细胞中上调，134个下调。值得注意的是，许多Treg细胞的关键标志基因在ex-Foxp3细胞中表达量大幅降低，包括编码转录因子的Foxp3、Gata1、Ikzf2和Ikzf4，以及编码免疫抑制相关分子或受体的Il2ra（CD25）、Tnfrsf18（GITR）、Tnfrsf4（OX40）、Itgae（CD103）和Ctla4等。相反，ex-Foxp3细胞上调了一些效应T细胞相关的基因，如编码细胞因子的Il4、Il21、Ifng和Il2，以及转录因子Tcf7。这些结果表明，ex-Foxp3细胞已经基本丧失了经典的Treg细胞转录程序，其基因表达谱更接近于效应T细胞。
在LPS或IL-1β诱导的妊娠晚期炎症挑战中，Treg细胞并未扩大向ex-Foxp3的转化
最后，研究旨在验证促炎性早产模型是否会诱发Treg细胞不稳定性增加。研究人员向妊娠晚期小鼠注射LPS或IL-1β以诱导早产或炎症，然后在处理后不同时间点（6小时、24小时、48小时）分析udLN和子宫蜕膜中的细胞。结果显示，虽然LPS或IL-1β处理成功诱导了早产和强烈的局部及全身炎症反应（表现为细胞因子水平升高），但在任何时间点，无论是udLN还是子宫蜕膜中，ex-Foxp3细胞的数量和比例均未增加。同时，Treg细胞、效应T细胞或中性粒细胞的比例也未发生显著变化。这表明，即使在强烈的炎症应激下，妊娠晚期子宫微环境中的Treg细胞群体依然保持稳定，没有发生大规模的谱系丢失。
结论
本研究通过遗传学命运示踪模型，系统地评估了小鼠妊娠期间，特别是妊娠晚期炎症挑战下，子宫相关Treg细胞的谱系稳定性。研究发现，虽然存在一个持续表达促炎细胞因子的小型ex-Foxp3细胞群体，但妊娠过程本身以及模拟早产的炎症刺激并未导致Treg细胞向ex-Foxp3细胞的转化增加。相反，妊娠晚期的Treg细胞表现出了更强的稳定性倾向。转录组分析进一步证实ex-Foxp3细胞失去了经典的Treg细胞特征，而获得了效应T细胞相关的基因表达谱。综上所述，这项研究表明，在妊娠期间，即使面对强烈的促炎信号，子宫微环境中的Treg细胞也保持着高度的谱系稳定性和免疫抑制特性，其谱系失稳可能不是导致早产的关键机制。然而，该研究中发现的ex-Foxp3细胞是否在妊娠组织中具有任何生物学或病理生理学意义，仍有待未来研究阐明。
