《IET Nanobiotechnology》：Systematic Comparison of Droplet-Based and Microwell-Based Platforms for Comprehensive Single-Cell Transcriptomic Analysis in Clinical Samples
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本文系统比较了液滴式(10x Genomics)和微孔式(Singleron)两种主流单细胞RNA测序(scRNA-seq)平台在肺癌临床样本中的应用性能，揭示了平台在数据质量、基因偏好性、免疫细胞组成及细胞通讯等方面的系统性差异，为精准选择测序平台及跨平台数据整合提供了关键依据。
2.1. 数据质量与reads分布的平台特异性偏好
研究者使用来自相同患者肺腺癌组织的单细胞悬液，在液滴式(10x Genomics)和微孔式(Singleron)平台上进行平行测序。液滴式平台获得了总计47,401个高质量细胞，而微孔式平台获得了33,915个。数据质量控制(QC)指标显示，液滴式平台通常具有更高的总测序读段数(nCount)和每个细胞检测到的基因数(nFeature)，这可能是由于液滴内高浓度的寡聚(dT)引物能更有效地捕获多聚腺苷酸化转录本。然而，微孔式平台保留了更高比例的成熟mRNA，其外显子区域可靠比对读段的平均比例高达87.62%，而液滴式平台仅为62.93%。同时，微孔式平台显示出更高的线粒体基因(%MT)占比以及应激相关转录本(如FOS, JUN)的表达水平，表明其可能更偏好于捕获应激相关的细胞特征。这些趋势在公共数据集中得到了验证。
2.2. 平台间批次效应的评估与消除
主成分分析(PCA)显示，平台间的批次效应超过了相同组织类型样本间的生物学差异。UMAP可视化与聚类评估指标(调整兰德指数Batch_ARI和平均轮廓宽度Batch_ASW)表明，液滴式平台样本间的批次效应小于微孔式平台。在整合六个样本后，未校正的数据显示出显著的批次效应。应用Harmony、Seurat和Liger等主流批次校正方法后，UMAP图显示细胞在各样本间有效混合，定量指标(Batch_ARI和Batch_ASW)均得到显著改善，证明这些工具能有效缓解跨平台的批次效应。
2.3. 微孔式平台更准确地还原免疫细胞比例
批次校正后，细胞被分类为上皮细胞、免疫细胞和基质细胞。液滴式平台捕获的免疫细胞比例始终高于微孔式平台。然而，微孔式平台得到的免疫细胞平均比例更接近流式细胞术的验证结果。这表明液滴式平台可能因主动的微流体液滴封装而高估了悬浮生长的免疫细胞的丰度，而微孔式平台通过重力沉降的被动捕获方式更能反映组织的真实组成。
2.4. 细胞亚型检测的平台依赖性变异
在细胞亚型分辨率上，液滴式数据集鉴定出8个细胞亚型，而微孔式数据集鉴定出9个。一个关键区别是，微孔式平台能够检测到一个独特的中性粒细胞群体，而该群体在液滴式数据集中几乎完全缺失。中性粒细胞在每个细胞中检测到的基因中位数最低，表明微孔式平台对mRNA含量低的脆弱细胞具有更高的捕获效率。
基因表达分析发现，在同一细胞类型(如成纤维细胞)中，两个平台间存在一部分基因表现出相反的表达趋势，这可能是由于平台间不同的RNA捕获偏好性所致。
细胞通讯(CellChat)分析显示，在患者1中，液滴式平台推断出的细胞间相互作用数量显著高于微孔式平台，其相互作用网络也更广泛。总体而言，所有患者中，液滴式平台的样本推断出的相互作用总数都更高。配体-受体(LR)互作分析表明，液滴式数据在多个关键的免疫相关信号通路(如MHC、IL1、TNF)中捕获了更全面的互作谱。
在免疫细胞亚群分析中，液滴式平台鉴定出5个T细胞亚型(包括细胞毒性CD8+效应T细胞、免疫抑制性CD4+T细胞等)，而微孔式平台仅鉴定出4个，缺失了免疫抑制性CD4+T细胞，表明后者在检测稀有免疫细胞亚群方面敏感性相对有限。
在上皮细胞亚群分析中，微孔式平台鉴定了6个簇，而液滴式平台鉴定了8个簇，但微孔式平台的UMAP图显示出更清晰的聚类分离。
拟时序(Pseudotime)分析揭示，液滴式平台在上皮细胞中展现了11种细胞状态和更复杂的分支进化轨迹，而微孔式平台仅检测到5种状态，未能区分某些关键细胞状态。
3. 讨论
本研究系统比较了两种单细胞测序技术在临床样本中的表现。最显著的发现之一是读段比对模式的差异，微孔式平台具有更高的外显子比对率，而液滴式平台则有更高比例的内含子比对。这反映了平台在测序深度、RNA捕获策略和特异性偏倚上的差异。
研究还强调了平台特异性技术偏倚对数据整合的重要性。主成分分析和聚类评估指标均表明平台差异是批次效应的主要来源，但主流校正工具能有效缓解此问题。
在细胞组成方面，液滴式平台检测到更高比例的免疫细胞，可能更适用于关注免疫组成的研究；而微孔式平台提供了更接近真实组织状态的免疫细胞比例，并独特地检测到了中性粒细胞，这对研究骨髓细胞至关重要。基因表达趋势和细胞通讯模式的平台间不一致性，提示在解释低丰度转录本和推断细胞间信号网络时需要谨慎。
综上所述，本研究强调在选择单细胞测序平台时，需仔细考虑其技术特性对数据质量、细胞类型识别、基因表达谱乃至生物学通路富集分析的系统性影响。这些发现为优化单细胞实验设计、促进跨平台数据解读与整合提供了宝贵的见解。
