基于高热辅助液相蛋白变性消化法的UHPLC–MS/MS定量分析人细胞质醛氧化酶-1 (AOX1)：实现低飞摩尔级精准定量

《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》：UHPLC–MS/MS Quantification of Human Cytosolic Aldehyde Oxidase: Heat-Assisted In-Solution Protein Denaturation and Digestion

本文系统优化了用于UHPLC–MS/MS绝对定量人细胞质醛氧化酶-1 (AOX1)的样品前处理流程，通过高热辅助（80°C加热15分钟）液相蛋白变性结合4小时消化，显著提高了替代肽VFF的产率。研究确立了包含40%水-10%乙腈-50%碳酸氢铵缓冲液的溶剂体系以增强肽溶解性与检测线性，并首次验证了AOX1阴性细胞质作为空白基质的适用性。所建立方法的验证指标均符合FDA指南，具备更短的运行时间（11.5分钟）、更高的灵敏度（7.5 fmol）和更宽的线性范围（7.5–10,000 fmol），首次实现了在低表达细胞与组织中对AOX1蛋白的低飞摩尔级精准定量，为定量其他低丰度胞质蛋白提供了方法学参考。

引言背景

超高效液相色谱-串联质谱 (UHPLC–MS/MS) 作为一种靶向定量蛋白质组学方法，已逐渐成为比免疫分析法更优的选择。其绝对定量基于对目标蛋白进行胰蛋白酶消化后产生的替代肽进行定量，并使用稳定同位素标记 (SIL) 肽段作为内标，通过多反应监测 (MRM) 模式实现高选择性。醛氧化酶 (AOX) 是一种钼黄素酶，参与多种内源和外源物质的代谢。人醛氧化酶-1 (AOX1) 蛋白的表达水平以往多通过免疫染色、免疫印迹或酶联免疫吸附试验等抗体法测定，但这些方法对某些低表达细胞类型或样本的灵敏度不足。近年来，UHPLC–MS/MS 已应用于测定人组织来源样品（如肝S9、胞质组分等）中的AOX1蛋白水平，但这些研究对于关键的蛋白变性和消化方案细节往往语焉不详。由于蛋白变性和消化的质量是决定目标肽产量、重现性、基质干扰程度以及最终定量准确度与精密度的重要因素，因此本研究的目的是系统优化AOX1蛋白的样品前处理流程并开发一个快速、灵敏且经过全面验证的UHPLC–MS/MS定量方法。

方法优化与建立

本研究选择已报道信号最强的AOX1替代肽⁴⁴⁶VFFGEGDGIIR⁴⁵⁶（简称VFF）及其稳定同位素标记内标 (VFF*) 作为分析目标。首先，系统评估了多种蛋白变性和消化条件。通过比较不同变性方案（如脲、RapiGest、加热、乙腈添加等）和消化时间对替代肽产量的影响，发现加热（80°C，15分钟）结合DL-二硫苏糖醇还原的变性方案能产生最高的消化效率，且在消化步骤中添加乙腈并未进一步提高效率，因此优化方案中未在消化阶段加入乙腈。同时，确定4小时的消化时间已足够。优化后的样品前处理流程明确为：蛋白样品在碳酸氢铵缓冲液中与还原剂一同加热变性，随后烷基化，再以1:50的胰蛋白酶/蛋白比例于37°C消化4小时。

其次，针对肽段标准品制备的溶剂条件进行了细致优化。由于VFF肽段含多个非极性残基，易因溶解性和塑料管壁吸附导致检测非线性。研究发现，使用40%水、10%乙腈、50%碳酸氢铵缓冲液 (pH 8.0) 的混合溶剂溶解肽储备液，以及用50%乙腈-50%碳酸氢铵缓冲液稀释工作液，可显著提高肽段溶解性，并使得标准曲线在7.5至10,000 fmol的宽达1333倍的范围内保持优异线性 (r²> 0.99)。

再者，为准确测定低表达样品，需要合适的空白基质以校正基质效应。通过评估，发现小鼠肝癌细胞Hepa1-6的胞质组分不表达AOX1，且其作为空白基质对校准曲线斜率的影响小于10%，因此被选定为后续实验中制备标准曲线和质控样品的理想空白基质。

基于上述优化，建立了UHPLC–MS/MS分析方法。色谱分离使用C₁₈柱，以含0.1%甲酸的水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，总运行时间仅为11.5分钟，是目前同类方法中最短的。质谱检测采用正离子电喷雾电离和MRM模式，监测VFF (m/z605.3 → 963.4) 和VFF* (m/z610.5 → 973.5) 等特征离子对。

方法学验证

对所建立的UHPLC–MS/MS方法进行了全面验证。选择性实验显示，空白基质及内标均不干扰目标肽的检测。方法的定量下限 (LLOQ) 低至7.5 fmol（相当于上柱量1.9 fmol）。在LLOQ及低、中、高浓度质控样品中，日内和日间准确度（偏差%）与精密度（变异系数%）均满足美国FDA生物分析方法验证指南的要求。稳定性实验证明，肽段在样品制备过程的蒸发、自动进样器保存（4°C）、短期冻存（-20°C）以及反复冻融条件下均表现稳定。与以往报道的AOX1定量方法相比，本方法在运行时间、线性范围、验证完整性等方面均展现出优势。

方法应用

应用优化后的方法和验证体系，成功实现了对人组织胞质、重组AOX1酶以及培养细胞中AOX1蛋白的绝对定量。首次在以往报道为检测不到的人肺胞质中定量出AOX1。在人组织胞质和重组酶样本中，AOX1蛋白含量与其介导的carbazeran 4-氧化酶活性呈显著正相关 (r= 0.96)，证实了定量结果的准确性。尤为重要的是，首次在培养的人细胞系中实现了AOX1定量：不仅在人肝癌细胞HepG2中检测到较高水平的AOX1 (2151 ± 111 fmol/mg蛋白)，也在人乳腺癌细胞MCF-7和人结肠腺癌细胞LS180中成功定量了低丰度的AOX1，其水平分别约为HepG2细胞的4.4%和2.0%。这些细胞中AOX1的表达水平在不同传代次数和培养条件下保持稳定。

结论与意义

本研究成功开发并验证了一个灵敏、快速、稳健的UHPLC–MS/MS方法，用于AOX1蛋白的绝对定量。其方法学创新点包括：1) 建立了高效的高热辅助液相蛋白变性消化方案，提高了肽段产率；2) 优化了溶剂组成，拓展了标准曲线的线性范围；3) 全面验证了方法性能，获得了更优的检测指标；4) 确定了AOX1阴性胞质作为空白基质，首次实现了在低表达细胞中对AOX1蛋白的低飞摩尔级精准定量。这项研究为AOX1蛋白的精准定量提供了可靠工具，其优化的样品前处理流程和验证策略，也可作为定量其他低丰度胞质蛋白的方法学模板。