小鼠延髓头端交感调控区：依赖GABA与甘氨酸协同释放的抑制性电流机制

《The Journal of Physiology》：The sympathoregulatory region of the mouse rostral brainstem relies on both GABA and glycine to generate inhibitory currents

本文聚焦小鼠延髓腹外侧/腹内侧区（VLM/VMM）交感前神经元，揭示了这些神经元接受来自甘氨酸能神经元（表达甘氨酸转运体2, GlyT2）的单突触输入，并协同释放γ-氨基丁酸（GABA）与甘氨酸两种抑制性递质。研究通过光遗传学刺激、膜片钳记录及病毒示踪等技术，证实增强抑制性突触活动可促进甘氨酸释放，且持续性甘氨酸释放依赖于GlyT2介导的甘氨酸摄取。同时，鉴定了甘氨酸能神经元位于外侧巨细胞旁核与B?tzinger复合体，并揭示了VLM/VMM神经元中甘氨酸受体（GlyR）α1、α3与β亚基的表达模式。该研究阐明了GABA与甘氨酸在交感前神经元调控中的必要性与协同作用，为理解交感神经活动的基础抑制性环路提供了新视角。

　　

引言：中枢抑制性调控的基石

γ-氨基丁酸（GABA）与甘氨酸是中枢神经系统主要的抑制性神经递质，通过作用于离子型受体导致神经元超极化，抑制其活动。越来越多的证据表明，在脊髓、背侧耳蜗核、展神经核以及延髓腹外侧/腹内侧区（VLM/VMM）等多个脑区，存在GABA与甘氨酸的协同释放。交感前神经元位于腹侧脑干的VLM/VMM，它们向脊髓的交感节前神经元传递信息，在调节交感神经活动（SNA）中扮演关键角色。尽管甘氨酸能抑制在VLM/VMM交感前神经元中已被观察到，但其输入来源与释放机制尚不明确。本研究旨在探究VLM/VMM交感前神经元是否接受甘氨酸能输入，并阐明其释放机制。

方法：多技术联合的研究路径

本研究采用多种神经解剖学与电生理学方法。通过将GlyT₂^Cre小鼠与通道视紫红质2（ChR2）小鼠杂交，获得在GlyT₂表达神经元中特异性表达ChR2的GlyT₂^ChR2/EYFP小鼠。利用伪狂犬病毒（PRV-614）逆行标记VLM/VMM交感前神经元，并在脑干切片上进行全细胞膜片钳记录。药理学实验使用荷包牡丹碱（bicuculline）和士的宁（strychnine）分别阻断GABA_A受体（GABA_AR）与甘氨酸受体（GlyR）。使用4-氨基吡啶（4-AP）增强神经元网络兴奋性，使用河豚毒素（TTX）鉴定单突触连接，并使用GlyT₂抑制剂ORG25543探究甘氨酸摄取的作用。此外，结合单突触与跨突触病毒追踪技术定位甘氨酸能神经元，并通过免疫荧光染色检测VLM/VMM神经元中GlyR α1、α3和β亚基的表达。

结果核心发现

1. 增强网络活动促进甘氨酸释放

对PRV标记的VLM/VMM交感前神经元进行膜片钳记录发现，自发性抑制性突触后电流（sIPSC）由GABA与甘氨酸共同介导。应用GABA_AR阻断剂荷包牡丹碱后，约60%的sIPSC电流（I_phasic）对荷包牡丹碱不敏感。在荷包牡丹碱存在下，应用钾通道阻断剂4-AP以增强网络兴奋性，显著增加了sIPSC的频率与I_phasic，而随后应用的GlyR阻断剂士的宁则能消除这些剩余的电流。这表明，增强抑制性突触活动可促进甘氨酸的释放。

2. 刺激GlyT₂纤维触发GABA与甘氨酸共释放

光刺激GlyT₂^ChR2/EYFP纤维可在67%的记录的VLM/VMM交感前神经元中诱发出IPSC（eIPSC）。荷包牡丹碱可部分降低eIPSC的振幅与电荷转移，而联合应用荷包牡丹碱与士的宁则可完全阻断eIPSC，证实光诱发的电流由GABA与甘氨酸共同产生。进一步应用GlyT₂抑制剂ORG25543后，eIPSC的振幅与电荷转移均显著降低，表明GlyT₂介导的甘氨酸摄取对于维持甘氨酸能神经传递至关重要。

3. 甘氨酸能输入为单突触连接

应用TTX可完全阻断光诱发的IPSC，而随后在TTX存在下加入4-AP则可部分恢复IPSC，并伴有反应延迟的增加。这一经典方法证实了GlyT₂表达神经元与VLM/VMM交感前神经元之间存在单突触连接。

4. GlyT₂调控甘氨酸释放的持续性

通过给予不同间隔时间（IPI）的光刺激脉冲序列，研究了甘氨酸能突触的短时程可塑性。结果显示，在50 ms的短IPI下，后续脉冲诱发的电流幅度相对于第一个脉冲（P₁）出现显著抑制，随着IPI延长（如2000 ms），抑制程度减轻。这提示高频刺激易导致可释放囊泡池的耗竭。重要的是，在荷包牡丹碱存在下（即仅剩甘氨酸能成分），应用ORG25543抑制GlyT₂后，不仅P₁的幅度下降，后续脉冲与P₁的比值（P_n/P₁）也进一步降低，表明GlyT₂的活性对于维持高频刺激下甘氨酸的持续性释放至关重要。2 reduces glycine release">

5. 甘氨酸能神经元的定位与GlyR亚基表达

将逆向腺相关病毒pAAV-hSyn-DIO-EGFP注射到GlyT₂^Cre小鼠的VLM区，结合肾脏注射PRV-614进行示踪，发现投射至VLM/VMM交感前神经元的甘氨酸能神经元主要位于腹侧脑干，尤其是外侧巨细胞旁核（LPGi）和B?tzinger复合体（Bo）。免疫荧光染色显示，在VLM/VMM交感前神经元中，GlyR α1亚基的免疫反应性呈点状分布在神经元突起周围，α3亚基则弥漫性表达于胞体，β亚基亦有表达。这种差异分布提示α1与α3 GlyR可能分别位于树突与胞体，介导不同空间位置的抑制性输入。

讨论：协同抑制的意义与展望

本研究证实，在腹侧脑干，表达GlyT₂的神经元依赖GABA_A受体与甘氨酸受体共同产生抑制性突触后电流。VLM/VMM交感前神经元的sIPSC由GABA与甘氨酸的突触前释放共同生成，且增强网络活动会促进甘氨酸释放。光遗传学刺激甘氨酸能纤维可触发两种递质的共释放，且该输入为单突触连接。解剖学研究将甘氨酸能神经元定位于腹侧脑干的LPGi与Bo，并揭示了VLM/VMM神经元中GlyR α1、α3和β亚基的表达模式。

GABA与甘氨酸的共释放可能决定抑制的强度与时间特性。在听觉脑干核团中，GABA可作为GlyR的共激动剂加速IPSC动力学。除了突触后受体激活，这些递质还可逆行作用于突触前受体并影响囊泡内递质的包装。甘氨酸能神经传递在协调呼吸运动输出和形成正常呼吸模式中亦起关键作用。本研究之前的发现提示，在大鼠RVLM中阻断GlyR会缩短血压升高后肾交感神经活动的恢复时间，这可能意味着GABA控制兴奋性阈值，而甘氨酸则在突触活动增强时增强抑制强度。

本研究的发现表明，GlyT₂表达神经元释放GABA与甘氨酸以抑制VLM/VMM交感前神经元。sIPSC的双组分特性最可能的解释是甘氨酸能中间神经元囊泡内GABA与甘氨酸的量子化共释放。在讨论交感活动的基础机制时，需考虑这种双递质释放模式。GlyT₂位于甘氨酸能神经元的轴突末梢，对甘氨酸摄取贡献巨大，其阻断几乎消除了GlyT₂^ChR2/EYFP表达神经元在单次或连续光刺激下的甘氨酸释放，凸显了GlyT₂在腹侧脑干甘氨酸能神经传递中的核心作用。

总之，该研究揭示了VLM/VMM区抑制性环路中GABA与甘氨酸协同作用的新机制，强调在理解交感前神经元功能与交感输出调控时，必须同时考虑这两种抑制性神经传递。这为未来探索相关神经系统疾病（如心血管调节异常、呼吸紊乱）的病理机制与潜在治疗靶点提供了重要的理论基础。