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作为生态学和分子生物学交叉领域的重要研究，本文系统评估了不同采样设计（包括采样深度、子样本数量、面积）和样本处理策略（土壤池化和DNA池化）对基于高通量测序的土壤动物、细菌和真菌多样性评估的影响。研究发现，采样设计可导致高达27倍的多样性估计差异，而池化策略能显著降低人力与成本，但可能造成多样性信息损失或群落同质化。该研究为全球土壤生物多样性监测项目的标准化采样方案设计提供了关键数据支撑和实用建议。
土壤生物多样性评估：采样设计、样本处理与群落洞察
引言
确定一个适当的采样设计是生物多样性调查的基本问题，它关系到研究问题、目标生物和资源。次优的采样设计可能会因采样空间格局、样本大小、样本体积和采样面积的不同而导致生物多样性估计产生偏差。此外，由于主观性或对地点选择或采样过程描述不足，高达95%的采样策略是不可重复的。对于土壤微生物多样性研究而言，很大程度上随机的群落组装、空间聚集以及巨大的分类学丰富度，使得采样设计的选择比大型生物更为复杂。为了在保持代表性的同时降低实验室成本，涉及子采样的采样设计在分子生态学中很常见。通常，在DNA提取之前或之后将子样本合并，以降低样本处理和分子分析的成本。然而，样本合并引起了一些技术上的担忧，包括子样本质量和数量的均一性以及总体稀释效应。本研究基于PacBio和Illumina扩增子测序技术，评估了采样设计和合并策略在恢复土壤栖息的细菌、真菌和动物丰富度方面的效应。研究有三个主要目标：(1) 评估现有广泛使用的采样设计在恢复不同生物类群多样性方面的相对表现；(2) 估计在DNA提取前合并土壤或在PCR步骤前合并DNA提取物对物种恢复的影响；(3) 为考虑与合并相关的采样设计和分析策略时的决策提供信息。
方法
研究在爱沙尼亚塔尔图县三个天然森林地点的土壤中进行。评估了多种来自广泛使用的大陆和全球宏条形码生物多样性项目的土壤采样设计，包括不同子样本数（N）、采样深度（D）和面积的组合。对于每种设计，采用了三种样本处理策略：非合并策略、土壤合并策略和DNA合并策略。使用通用引物对真菌ITS区、动物COI基因和细菌16S rRNA基因进行PCR扩增，并分别使用PacBio Sequel II和Illumina NovaSeq 6000进行测序。生物信息学分析采用了各自类群当前的最佳实践流程。所有统计分析均在R语言环境中进行，使用线性混合模型、PERMANOVA等方法评估采样设计、合并策略对OTU丰富度、香农多样性指数和群落组成的影响。
个体样本多样性因采样设计而异
个体土壤样本中的多样性估计因采样设计而异，具体取决于采样深度和目标类群。对于动物而言，采用 N9D0–1和 N62D0–5设计获得了最高的OTU丰富度。细菌OTU丰富度在 N62D0–5和 N40D0–5A设计中显著高于所有其他设计。相反，真菌OTU丰富度在除 N9D30–40设计（显著较低）外的各采样设计间没有显著差异。基于PERMANOVA检验，采样设计间的群落组成差异略大于设计内的差异。采样设计在群落组成的变异性上也存在显著差异，其中 N5D0–20设计的离散度最低。
采样设计影响总体生物多样性估计
基于非合并采样的点位总OTU丰富度，对于具有大量子样本的表层土壤采样设计最高。采样设计之间的丰富度比值对于动物、细菌和真菌分别高达26.8、5.9和14.7倍。具体而言，与子样本较少的设计相比，N40D0–5设计分别多捕获了2.4–22.1倍、1.7–4.8倍和1.7–11.5倍的动物、细菌和真菌OTU。N5D0–20和 N9D30–40设计通常揭示的每个点位OTU数量显著低于其他设计。与 N9D0–10设计相比，N9D0–40设计（即合并表土和底土样本）平均为动物、细菌和真菌的OTU丰富度增加了4.8%、54.1%和17.3%；然而，这些值显著低于 N62D0–5和 N9D0–1设计的值，这表明除了细菌外，额外采集底土或深层岩心对恢复的丰富度增加不多。在所有点位，底土仅包含动物、细菌和真菌分别0.6%、4.9%和1.5%的特有OTU。研究还专门测试了采样面积对丰富度恢复的重要性，在 N62D0–5设计内，在327至2000 m2的矩形采样面积范围内，采样面积对任何生物类群的OTU丰富度都没有影响。
样本合并减少了采样设计间的差异
与非合并样本类似，N62D0–5设计的合并样本揭示了最高的OTU数量和香农指数。然而，合并采样设计间丰富度和香农多样性指数的变异性低于非合并采样的采样设计间变异性。具体而言，在合并样本中，N40D0–5与其他设计（不包括 N9D30–40）之间的丰富度比值，对于动物、细菌和真菌分别为0.9–3.1倍、0.8–2.2倍和0.9–3.5倍。对于细菌和真菌，合并采样设计间的群落组成相似性高于非合并采样，但对于动物则不然。与 N40D0–5设计相比，N50D0–7.5、N25D0–7.5和 N75D0–7.5设计通常捕获的动物和真菌OTU较少。在所有设计中，DNA合并策略比土壤合并策略揭示了更多的动物和真菌OTU，但对细菌没有影响。
不同测序深度下的样本合并效应
合并效应定义为合并样本与非合并样本在捕获的点位多样性估计值之间的比值。PE100%的范围在动物、细菌和真菌中分别为0.4–5.8、0.5–2.4和0.6–1.7，具体取决于采样设计和合并策略。对于密集采样的 N62D0–5、N40D0–5A和 N40D0–5B设计，样本合并导致了动物和真菌的OTU损失。相比之下，在其他采样设计中，DNA和仅 N9D30–40土壤合并设计增强了真菌OTU的恢复。土壤和DNA合并在除 N62D0–5外的所有采样设计中都增强了细菌OTU的恢复。此外，DNA和土壤合并仅提高了 N5D0–20和 N9D0–10设计捕获动物OTU的能力。合并效应随测序深度而变化，并且在生物类群间存在差异。DNA和土壤合并在≤100%总结测序深度下并未改善动物多样性检测。然而，对于细菌和真菌，分别仅需大约25%和75%的测序努力就足以在OTU恢复方面优于非合并采样。就丰富度而言，DNA池的合并效应相对高于土壤池对于动物和真菌，而土壤合并揭示了相对更多的细菌OTU。研究计算表明，对于 N40D0–5设计，在采样阶段进行样本合并可以为100个样地节省97.3%的化学品资源、76.9%的测序文库制备成本以及365人时的工作量。
分子分析伪影对合并效应的贡献
为了理解样本合并效应对生物多样性估计的影响机制，研究评估了PE是否可归因于稀有物种或未发现的分子分析伪影。在100%总结测序深度下，DNA池，尤其是那些PE < 1的，与非合并样本相比，检测到的特有OTU和稀有OTU显著更少，并且产生的特有伪影也更少。这些模式在Vasula采样点尤为明显。土壤池在稀有、特有和伪影OTU数量上与非合并样本没有差异。同时，DNA和土壤合并都捕获了更少数量的稀有伪影，但导致了更高比例的稀有伪影。
讨论
研究发现，采用非合并采样时，采样设计间丰富度估计值的差异可能超过27倍。这取决于生物的分类群和采样设计的属性，包括土壤深度、子样本数量和采样面积。分析表明，动物、细菌和真菌的物种随着超过200个个体样本的采样努力增加而继续累积，这表明采样努力对采样设计间恢复的多样性差异有重大贡献。与土壤生物量的积累和生物多样性集中在表层几厘米相一致，在5厘米深度采样足以捕获大部分动物、细菌和真菌多样性。建议为动物、细菌和真菌至少采集30个子样本。额外的采样努力取决于预期的采样区域、植被穿透的难易程度以及所研究系统的异质性。采样面积的大小在327–2500 m2范围内对丰富度估计没有影响，但它应考虑空间自相关范围、潜在的边缘效应和植被类型。考虑到劳动力和分析成本，除非旨在进行局域尺度的β多样性或物种共现分析，否则在现场进行样本合并是可行的。考虑到合并对多样性的微小但显著的缺点，如果预算允许，可以单独分析2-3个较小的土壤池，并汇总结果。由于合并的同质化效应，使用合并样本在将数据与其他具有不同采样设计的研究进行比较时也是可行的。
结论
对于土壤的分子生物多样性调查，代表性采样是必要的。考虑到土壤生物量和生物多样性在表层几厘米的积累，在5厘米深度采样足以捕获大部分动物、细菌和真菌多样性。建议为动物、细菌和真菌至少收集30个子样本。额外的采样工作量取决于预期的采样面积、植被穿透的难易程度以及所研究系统的异质性。采样面积的大小在327-2500 m2范围内对丰富度估计没有影响，但应考虑空间自相关范围、潜在的边缘效应和植被类型。考虑到劳动力和分析成本，除非旨在进行局地尺度的β多样性或物种共现分析，否则现场样本合并是可行的。考虑到合并对多样性的微小但显著的不利影响，如果预算允许，可以分别分析2-3个较小的土壤池，然后汇总结果。由于合并的同质化效应，使用合并样本在将数据与其他具有不同采样设计的研究进行比较时也是可行的。
