《Oxidative Medicine and Cellular Longevity》：Oxidative and Inflammatory Damage by Environmental Polyethylene Microplastics in Caco-2 Cells Is Prevented by Polyphenol-Rich Limoncella Apple Extract
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本研究探讨了环境性聚乙烯微塑料（Polyethylene microplastics, PE-MPs）对人肠道上皮细胞（D-Caco-2）的毒性作用，并评估了富含多酚的Limoncella苹果提取物（LAPE）的保护潜力。研究证实PE-MPs可诱导氧化应激、增加细胞膜脂质过氧化、破坏紧密连接蛋白（如occludin）并引发上皮-间质转化（EMT），从而导致细胞活力和肠道屏障功能下降。然而，LAPE凭借其抗氧化和抗炎特性，显著逆转了PE-MPs诱导的细胞毒性、脂质过氧化、屏障通透性增加及EMT相关标志物变化。这些发现为利用膳食多酚作为功能性营养策略，以减轻微塑料在胃肠道中引起的损伤提供了重要的实验依据。
1. 引言
在当今时代，塑料和微塑料（MPs）因其持久性和广泛分布，已成为普遍存在的环境污染物。这些颗粒广泛存在于陆地和水生生态系统中，最终可通过饮食暴露进入人体组织。微塑料被定义为小于5毫米的固体塑料碎片，聚乙烯（PE）、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚苯乙烯（PS）是使用最广泛的种类。动物研究表明，吸收后的MPs可易位至肝脏、肾脏、脾脏、肺、生殖组织乃至中枢神经系统等多个器官，引发了对其全身毒性的担忧。
人类接触MPs的主要途径之一是摄入，但其对胃肠道（GI）的潜在影响尚不完全清楚。然而，近期证据表明，胃肠道暴露于MPs会诱导氧化和炎症稳态失衡，并增加小鼠肠道上皮通透性。此外，在炎症性肠病患者的粪便中检测到的MPs浓度显著高于健康个体。肠道上皮屏障的损害被认为是导致各种影响胃肠道的慢性炎症性疾病发病的关键因素。肠道紧密连接蛋白在维持上皮完整性和调节通透性方面发挥重要作用，从而防止毒素和病原体从肠腔易位至血液。
在氧化应激期间，过量的自由基产生会改变紧密连接蛋白的结构，导致免疫激活。在恶性循环中，长期暴露于炎症刺激会导致肠细胞极性和分化的丧失，最终进展为上皮-间质转化（EMT）。多酚是一组具有明确抗氧化和抗炎特性的多样化生物活性化合物，对维持肠道屏障完整性有显著贡献。其中，姜黄素、槲皮素、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和白藜芦醇等多酚已被报道可抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路。在肠道上皮中，该通路对于隐窝内的干细胞增殖和分化以及EMT和癌干细胞的异常扩增至关重要。
最近，从“Limoncella”苹果中提取的特定多酚提取物（LAPE）已被证明在DNBS诱导的结肠炎模型中可显著降低血清脂质过氧化和肝损伤，并抑制核因子κB（NF-κB）的激活。本论文评估了环境性聚乙烯微塑料（PE，2.6 μm）在分化Caco-2（D-Caco-2）细胞（人类肠上皮细胞的良好模型）中的毒性。此外，我们研究了LAPE对PE处理的D-Caco-2细胞在细胞活力、脂质过氧化、分化和EMT方面的保护作用。
2. 结果
2.1. LAPE通过减少脂质过氧化来抵消环境性聚乙烯的细胞毒性作用
为了评估聚乙烯（PE）对D-Caco-2细胞的有害影响，在治疗24、48和72小时后通过MTT法进行了细胞毒性评估。我们观察到，与未处理的对照细胞（CTR）相比，2.5 μg/mL的PE在72小时后使D-Caco-2细胞活力降低约50%。有趣的是，随着PE浓度的增加，观察到其对D-Caco-2细胞的细胞毒性效应反而降低。这种现象可能是因为PE在水溶液中的聚集能力导致细胞摄取减少。
添加LAPE（80 μg/mL），无论是与PE联合使用还是在PE处理后使用，均在72小时后抵消了PE对D-Caco-2细胞的细胞毒性效应。此外，我们研究了氧化应激是否会加剧PE对D-Caco-2细胞的细胞毒性作用。过氧化氢（H2O2）暴露的D-Caco-2细胞（DH-Caco-2）用PE处理后，评估其活力。与DH-Caco-2 CTR相比，PE处理的DH-Caco-2细胞显示出约45%的细胞毒性。这种效应仅在LAPE与PE联合添加时才得到缓解。
基于这些发现，所有后续实验均在D-Caco-2细胞中同时添加PE/LAPE组合（2.5 μg/80 μg 每毫升）处理72小时。
通过硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定评估了PE、LAPE及其组合对脂质过氧化的影响。结果表明，与CTR相比，PE MPs增加了D-Caco-2和DH-Caco-2细胞中的脂质过氧化。在两组处理的细胞中，这种效应均被PE/LAPE组合显著逆转。
当H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤时，细胞膜的通透性增加，促进细胞内乳酸脱氢酶（LDH）释放到外部环境中。因此，LDH可用于反映Caco-2细胞的氧化损伤程度。如图2B所示，在D-Caco-2和DH-Caco-2细胞的正常培养条件下，细胞培养基中的LDH含量分别为90–100 U/L和120–130 U/L。LAPE处理后，我们未观察到D-Caco-2或DH-Caco-2细胞中LDH含量的任何变化。当用PE刺激D-Caco-2和DH-Caco-2细胞时，培养基中的LDH含量分别为120 U/L和160 U/L。在PE处理的DH-Caco-2细胞中，与未处理的DH-Caco-2细胞相比，LDH含量增加了约33%。LAPE单独的抗氧化作用以及与PE联合使用时，都将LDH值恢复到与D-Caco-2细胞相当的水平。
2.2. 聚乙烯诱导的高通透性、降低D-Caco-2细胞中闭合蛋白和NF-κB的表达
值得注意的是，已有报道称微塑料（MPs）可通过增加氧化应激诱导肠上皮屏障损伤。因此，我们探索了LAPE的抗氧化特性是否可以恢复肠道屏障通透性。
在Transwell系统中培养的D-Caco-2单层细胞用于评估对离子和溶质的细胞通透性。使用乳果糖/甘露醇（L/M）5:1摩尔比（一种成熟的肠道通透性标记物）评估了肠道通透性。用PE处理D-Caco-2细胞使基底外侧溶液中的L/M比率增加了约3倍，而PE/LAPE组合则恢复了细胞通透性，使L/M比率恢复到接近CTR（未经处理的细胞）的基线水平。
为了进一步研究PE诱导的肠上皮屏障功能障碍，通过蛋白质印迹分析检测了闭合蛋白（occludin）的表达。如图3所示，PE处理的D-Caco-2细胞显著降低了闭合蛋白的表达，而PE/LAPE组合处理可逆转此现象。多酚提取物的抗炎特性是已知的。在此，我们通过蛋白质印迹分析了暴露于PE、LAPE和PE/LAPE组合的D-Caco-2细胞中NF-κB蛋白水平的变化。我们的数据显示，与CTR细胞相比，LAPE和PE/LAPE组合处理的D-Caco-2细胞中NF-κB均降低。
2.3. 聚乙烯诱导D-Caco-2细胞发生上皮-间质转化和去分化
脂质过氧化可导致生物膜通透性改变，从而破坏正常的细胞功能。这一发现促使我们研究PE诱导的脂质过氧化增加是否影响D-Caco-2细胞的EMT和去分化。具体来说，我们检查了PE在D-Caco-2细胞中对F-肌动蛋白和碱性磷酸酶蛋白细胞定位的作用。PE处理D-Caco-2细胞72小时后，与CTR细胞相比，我们观察到细胞质中F-肌动蛋白纤维聚集。此外，通过共聚焦显微镜和碱性磷酸酶（ALP）活性检测到的ALP蛋白信号降低表明，PE处理的D-Caco-2细胞中出现了明显的去分化过程。有趣的是，用PE/LAPE组合处理72小时后，与PE处理的D-Caco-2细胞相比，F-肌动蛋白的重新分布和ALP信号的减少得到部分逆转。
3. 讨论
微塑料（MPs）通过摄入海洋和陆地食物接触人体胃肠道屏障，并对人体肠道产生一些负面影响。利用有代表性的被摄入形式的环境性微塑料（EMPs）进行的研究很少。本研究的目的是在体外评估环境性聚乙烯（EPE）对分化的人结直肠腺癌细胞系（D-Caco-2）的影响，该细胞系类似于肠上皮细胞，可以模拟胃肠系统的小肠。微塑料毒性的常见机制包括细胞膜破坏、内化和活性氧（ROS）产生。在本研究中，我们报告了环境性聚乙烯微塑料（EMPs-PE）对D-Caco-2细胞单层的活力、脂质过氧化、通透性和屏障功能的不利影响。
Caco-2细胞可以通过吞噬作用摄取0.5至10 μm的颗粒。在我们的实验条件下，大小为2.6 μm的环境性聚乙烯（EPE）以剂量和时间依赖性方式影响D-Caco-2细胞活力。孵育72小时后，在2.5 μg/mL浓度下达到了IC50值。有趣的是，当PE浓度增加到5 μg/mL时，D-Caco-2细胞活力恢复到与D-Caco-2 CTR相同的值。这种效应可能是由于PE在水溶液中的聚集能力，可能导致细胞摄取减少。动物研究表明，暴露于微塑料可通过产生ROS导致肠道屏障功能障碍。膳食多酚正在成为预防和治疗涉及肠道自由基相关疾病的药物；这些化合物可能有助于保护胃肠道免受食物中存在的或在食物消化过程中产生的ROS的损害。在我们之前的研究中，我们证明了来自Malus domestica cv. Limoncella（LAPE）的富含多酚的苹果提取物在二硝基苯磺酸（DNBS）诱导的小鼠结肠炎中具有胃肠道保护作用。LAPE改善了血清脂质过氧化并减少了NF-κB的激活。这些结果表明，LAPE通过其抗氧化和抗炎特性，可以预防炎症性肠病引起的损害。
因此，作为我们研究的进一步部分，我们研究了LAPE在D-Caco-2和H2O2处理的D-Caco-2细胞（DH-Caco-2）中预防PE细胞毒性作用的能力。在PE处理的D-Caco-2和DH-Caco-2细胞中，通过TBARS测定评估，细胞毒性是由于脂质过氧化增加所致。然而，在单独用LAPE和PE/LAPE组合处理的DH-Caco-2细胞中，与PE处理的细胞相比，TBARS浓度显著降低。
一些研究表明，天然抗氧化剂在金属离子存在下也可能表现出促氧化活性。有趣的是，当D-Caco-2细胞与LAPE单独孵育时，与CTR相比，TBARS浓度增加。LAPE在D-Caco-2和DH-Caco-2细胞之间效应的这种差异可能是由于我们的实验细胞模型。事实上，D-Caco-2细胞在刷状缘膜中表达消化酶和转运蛋白，这是小肠吸收上皮细胞的特征。这些极化细胞含有用于内源性和顶端积累的营养物以及其他膳食化合物的转运蛋白，以及许多激素、生长因子和金属转运蛋白（如二价金属转运蛋白1，DMT1）的受体。然而，重要的是要注意，LAPE处理的D-Caco-2细胞中TBARS浓度的增加并未导致细胞活力下降。
当H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤时，细胞膜的通透性增加，促进细胞内LDH释放到外部环境中。因此，我们使用LDH活性来反映DH-Caco-2细胞的氧化损伤程度。在PE处理的DH-Caco-2细胞中，细胞内LDH释放显著增加。然而，单独使用LAPE或PE/LAPE组合处理完全逆转了LDH的释放。这表明，凭借其抗氧化能力，LAPE可有效抵消PE通过脂质过氧化诱导的细胞毒性。最近的研究表明，PE MPs在通过增加氧化应激损伤细胞膜后会引发炎症。完整的肠道屏障对于防止氧化应激引起的细胞损伤和恢复细胞功能非常重要。通过测量基底外侧的乳果糖/甘露醇比率研究了72小时处理后屏障的通透性。PE处理增加了通透性，导致D-Caco-2细胞屏障功能失调。然而，PE/LAPE处理显著改善了通透性，表明D-Caco-2细胞的屏障功能得到恢复。
脂质过氧化增加诱导上皮细胞损伤，导致细胞紧密连接破坏、肌动蛋白细胞骨架重组、去分化和随之而来的炎症。先前的研究表明，用其他MPs处理可以改善癌症疾病进展。
通过F-肌动蛋白和β-连环蛋白免疫荧光染色观察细胞骨架的形态，同时通过蛋白质印迹分析评估紧密连接。PE处理破坏了D-Caco-2细胞中F-肌动蛋白纤维的组织并降低了闭合蛋白表达，而添加LAPE明显恢复了D-Caco-2细胞中F-肌动蛋白的组织和闭合蛋白表达。F-肌动蛋白的组织紊乱，加上PE诱导的紧密连接关联减少，可能赋予这些细胞恶性特性。临床和实验经验表明，分化和恶性程度呈负相关。在这里，我们通过共聚焦显微镜和刷状缘酶ALP的活性评估了D-Caco-2细胞的分化。在存在PE培养的D-Caco-2细胞中，ALP组织和活性均降低；这种效应被LAPE处理逆转。本研究的结果与一个机制模型一致，在该模型中，PE诱导的氧化应激启动脂质过氧化，导致膜不稳定并激活促进EMT的信号通路。已知增加的过氧化产物如MDA可激活NF-κB、MAPKs（ERK1/2、JNK和p38）和TGF-β/SMAD信号，所有这些都驱动细胞骨架重塑、紧密连接解体和上皮极性丧失。在PE处理的细胞中观察到的F-肌动蛋白破坏和闭合蛋白表达减少与此机制一致。LAPE的保护作用可能依赖于其清除ROS、抑制NF-κB活化和稳定膜脂质的能力，从而阻止这些EMT相关通路的激活。
本研究的一个局限性是仅使用分化的Caco-2细胞，尽管其被广泛用作肠上皮模型，但源自结直肠腺癌。其癌源性表型可能影响基础氧化状态、代谢途径和对异生物质应激源的反应。因此，虽然此处观察到的效应反映了对微塑料诱导的氧化应激的典型上皮反应，但未来的研究应包括非转化的肠道模型、人原代上皮培养物或肠道类器官，以确认我们研究结果的转化相关性。
4. 结论
本研究结果突显了聚乙烯（PE）对D-Caco-2细胞的细胞毒性作用，导致细胞活力呈剂量和时间依赖性降低，以及脂质过氧化增加。肠道屏障破坏通过通透性增加和紧密连接组织紊乱得到证实，表明微塑料可能对肠道功能障碍和炎症有贡献。然而，用富含多酚的Limoncella苹果提取物（LAPE）处理表现出保护作用，减少了氧化损伤并恢复了肠道屏障功能。这些发现表明，多酚可能是一种有前景的选择，可以减轻微塑料对肠道的负面影响，为其潜在的治疗应用研究铺平了道路。
