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本研究探讨了在固定时间（ZT2）进行的中等强度跑步机运动能否作为非药物性同步因子，增强荷瘤小鼠肿瘤组织中核心生物钟基因（如Per2、Per3和Rev-Erbα）表达节律的振幅，并观察到肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的峰值相位变化，为“时间运动”作为癌症治疗的潜在辅助手段提供了新证据。
引言：生物钟、癌症与运动的交汇点
昼夜节律是生物体为维持内稳态而演化出的分子机制，它驱动着日常行为和生理活动的节律。现代生活方式和暴露于人工光线等因素会削弱内源性节律的稳健性。值得注意的是，轮班工作者因昼夜节律紊乱，罹患乳腺癌和前列腺癌的风险增加。动物研究也证实，破坏中枢生物钟会促进异种移植瘤的生长。这种节律紊乱在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色，而致癌过程本身也会直接削弱昼夜节律。例如，在乳腺癌细胞中，所有三个Per基因的表达均失调；在大多数患者中，Per1表达下调。大量证据表明，Per1和Per2在小鼠中具有肿瘤抑制功能，而Rev-Erbα的表达也与癌症密切相关。除了遗传因素，生活方式是癌症发生的主要贡献者。身体活动不足等行为风险因素导致了约三分之一的癌症死亡。运动作为一种强大的外部授时因子，能够牵引昼夜节律，尤其在骨骼肌中，因此可能成为一种能够调节癌症风险和进展的非药物干预手段。然而，关于运动机制如何通过调节生物钟来影响癌症，人们知之甚少。因此，本研究旨在评估在固定时间或随机时间进行体育运动的效果，并探讨其作为时间标记物在荷瘤小鼠生物钟基因表达中的作用。
方法：构建时间运动干预的荷瘤小鼠模型
研究使用雄性C57BL/6J小鼠，饲养在可控的12小时光暗循环环境中。小鼠被分为三组：肿瘤对照组（CTRL）、运动组（Ex）。运动组又进一步分为在固定授时时间2（ZT2）训练的小组和在交替时间（ZTAlt）训练的小组。所有小鼠均皮下接种路易斯肺癌（LLC）细胞。交替训练方案包括在ZT2、ZT14、ZT6、ZT2和ZT6时段进行训练，其中ZT0定义为光周期开始（早上6点）。肿瘤接种三天后，动物开始为期3周、共计14次的跑台有氧训练，每次训练持续40-60分钟，强度为最大速度的60%。通过递增负荷测试确定每只小鼠的最大速度。为了探索肿瘤和/或运动可能诱导的昼夜变化，动物在24小时内以4小时间隔（ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20）被处死。
研究结果：固定时间运动增强肿瘤生物钟基因节律
实验结束后，各组动物初始体重均一。在交替时间运动组（Ex ZTAlt）中，肿瘤重量与对照组相比显著降低，减少了23%的肿瘤负荷；而在固定时间运动组（Ex ZT2）中，肿瘤重量仅观察到8.25%的适度减少。各组之间的脂肪组织指数没有显著波动。
在基因表达层面，固定时间运动（Ex ZT2）显著增强了肿瘤组织中多个核心生物钟基因的节律性：
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Per1：Ex ZT2组在ZT0时间点的表达高于对照组，但节律振幅和峰值相位均未显示显著差异。
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Per2：Ex ZT2组在ZT0和ZT4时间点的表达显著高于对照组。更重要的是，振幅分析显示Ex ZT2组与对照组之间存在显著差异，表明其节律振荡更加强健。对于Per2的昼夜表达模式，Ex ZT2组显示出更显著的节律性。
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Per3：Ex ZT2组在ZT0时间点的表达显著高于Ex ZTAlt组和对照组。振幅分析同样显示Ex ZT2组比对照组具有更大的振幅。
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Rev-Erbα：Ex ZT2组在ZT0时间点的表达显著高于对照组，其节律振幅也显著大于对照组。
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其他基因：包括Clock、Bmal1、Cry和Rorα在内的更广泛的生物钟基因面板未检测到节律参数的显著改变。
在细胞因子表达方面，虽然肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β、IL-10和IL-4的浓度或振幅均未发现显著差异，但峰值相位分析揭示了TNF-α的独特节律偏移：Ex ZT2组的峰值相位显著晚于对照组和Ex ZTAlt组，表明其表达高峰在一天中出现了延迟。
最后，通过人类肺癌患者的Kaplan-Meier生存分析评估了PER2和PER3基因的临床相关性，结果显示，较高水平的PER2和PER3基因表达与较长的总生存期相关。
讨论：时间运动作为潜在的癌症时间疗法
本研究的主要发现是，每天在固定时间进行的体育运动能够诱导肿瘤内Per2、Per3和Rev-Erbα基因的昼夜节律反应，显著增强其表达振幅。这些变化在每天同一时间（ZT2）训练的组别中尤为明显。相比之下，在久坐组或随机时间训练组中均未观察到基因振幅的显著改变。运动诱导的荷瘤小鼠肿瘤中Per2和Per3表达增加具有临床意义，因为Per基因家族的表达降低与肺癌患者的总生存期缩短有关。这凸显了运动作为肿瘤内昼夜节律调节因子的潜力，对癌症预后具有重要意义。
此外，交替时间运动组（Ex ZTAlt）中TNF-α的峰值相位增加，表明其表达高峰出现延迟。这种延迟可能反映了一种适应性调整，可在关键时期减轻炎症，这与运动公认的慢性抗炎作用相符。在癌症背景下，这一发现也为开发基于时间的治疗策略（如时间疗法）提供了有希望的途径。
昼夜节律基因的破坏可以影响癌症发展和进展的关键通路，包括细胞周期控制、代谢调节、DNA损伤反应和细胞凋亡。生理和遗传干扰（特别是Bmal1和Per2的抑制）可以与Kras和p53相互作用，促进肺部肿瘤发生。这说明了昼夜节律紊乱与肿瘤发展之间的紧密联系。
体育运动可以是同步昼夜节律的重要工具，并在癌症预防和管理中发挥重要作用。相反，癌症本身也会诱导昼夜节律的改变或破坏。本研究显示，体育运动调控了肿瘤组织中的生物钟基因表达，特别是Per2、Per3和Rev-Erbα基因。
清晨运动似乎比晚些时候运动对预防乳腺癌和前列腺癌提供更大的保护作用。同样，本数据证实，每天在固定时间（ZT2）进行的体育运动，其TNF-α浓度的峰值相位高于其他两组。已知TNF-α及其受体可以影响昼夜节律；刺激会导致TNF-α浓度升高，从而引起相位偏移。
TNF-α对肿瘤细胞死亡的影响在文献中已有充分探讨。TNF-α得名于其诱导肿瘤细胞死亡的能力。TNF-α可通过经典和非经典机制介导，激活肿瘤细胞中的死亡信号通路，增加细胞凋亡和细胞焦亡。此外，肿瘤部位TNF-α表达增加与抗肿瘤免疫力增强有关。TNF-α也能诱导CD8+ T细胞的高细胞毒性活性。
另一方面，肿瘤的发展导致血液中几种促炎介质水平升高，包括已知会导致骨骼肌损失的TNF-α。在本团队之前的工作中观察到，TNF-α的增加发生在肿瘤组织内，而不是骨骼肌中，这表明运动训练在荷瘤小鼠的肌肉中引发了抗炎反应。
本研究存在一些局限性。尽管ZT2训练的荷瘤小鼠显示出核心昼夜节律基因更稳健的振荡，但这并未转化为终点时肿瘤负荷的显著差异。鉴于干预时间相对较短，可能持续时间不足以揭示ZT2组肿瘤的统计学显著减少；在没有药物治疗的情况下，可能需要更长时间的运动方案才能引发这种效果。尽管如此，本研究结果与以下证据一致：肿瘤时钟动态比基线肿瘤生长更能影响治疗反应性；大规模分析表明，昼夜节律基因在多种癌症中经常发生改变，并与致癌和临床可操作的通路相互作用。
结论
每日按计划进行的有氧运动调节了荷瘤小鼠肿瘤组织中Per2、Per3和Rev-Erbα基因的昼夜表达，导致节律振幅增加，尽管并未增强肿瘤负荷。这些发现凸显了运动时机作为肿瘤学时间治疗策略的潜力。
