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本文综述了濒危药用植物羌活在青藏高原东南缘的遗传多样性、种群分化及其与环境因子的关联。研究采用ISSR标记揭示其遗传结构，发现遗传多样性受海拔、纬度及年均温显著影响，为羌活资源保育与良种选育提供了关键理论依据。
引言
羌活是广泛使用的中药材，属于伞形科，生长于青藏高原东部边缘的高山灌丛、亚高山灌丛及林缘，海拔范围在1700至4500米之间。其根茎入药，被《中国药典》收载，常用于治疗感冒、炎症如类风湿关节炎，具有发汗、解热、镇痛功效。由于国内外药材市场需求增长，当前供应主要依赖野生资源采挖，加之过度开发和人为活动导致的生境退化与破碎化，羌活已被世界自然保护联盟列为濒危物种。评估受威胁物种的遗传多态性是种质资源保育的前提。近年来，利用分子标记评估濒危植物种群的遗传多样性已成为制定有效保育策略的关键步骤。先前对羌活遗传多样性的研究限于少数种群或单一核基因，因此有必要扩大样本量并采用多种分子标记技术更详细地探究其种群间和种群内的遗传多样性，并研究遗传多样性与环境因子的相关性，以制定有效保育策略，确保羌活资源的可持续利用。
材料与方法
研究于2020-2021年间，从青藏高原东南缘四川、甘肃、青海三省交界的38个自然种群中采集了343份羌活叶片样品。所有样品经四川农业大学杨瑞武教授进行物种鉴定。详细地理信息见表1。
基因组DNA使用LABGENETM Plant DNA Isolation Kit提取。使用英属哥伦比亚大学第9套引物中的37条ISSR引物进行初步筛选，最终选用15条条带清晰、可重复且具有多态性的引物对所有343个个体进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
遗传数据分析方面，将扩增条带按有（1）或无（0）记入二元矩阵。计算总条带数、多态性条带数及多态性位点百分比。使用PopGene 1.32软件计算观测等位基因数、有效等位基因数、Nei's遗传距离和香农信息指数等遗传多样性参数，并估计总基因多样性、种群内多样性、遗传分化系数和基因流。基于Nei's遗传距离矩阵，使用MEGA 6软件通过非加权配对算术平均法构建聚类树。对种群间遗传距离矩阵进行中心化、标准化和归一化后，进行主成分分析以可视化种群结构。使用Arlequin 3.5.2.2进行分子方差分析，以划分种群内和种群间的遗传变异。
为分析种群进化历史，使用DIYABC软件，在广义逐步突变模型下评估替代进化情景并估计历史参数。将38个种群划分为两个基因库（N1和N2），测试了三种进化情景。
环境数据方面，根据经纬度计算种群间地理距离。从WorldClim和国家青藏高原科学数据中心获取海拔数据及2000-2021年间的月气候变量。使用ArcMap 10.4提取各采样点的气候值，并计算出三个关键年度生物气候变量：年均降水量、年均温和年均温度范围。
采用多种分析方法探究遗传多样性与环境因子的相关性。进行皮尔逊相关分析评估遗传多样性参数与地理/气候变量之间的关系。使用Mantel检验评估遗传距离与地理距离、以及遗传距离与地理或气候因子之间的相关性。使用冗余分析研究遗传多样性参数与多元环境梯度之间的线性关系。
结果
3.1 遗传多样性
15条ISSR引物共扩增出203个位点，所有引物均显示100%多态性。遗传多样性参数计算表明，观测等位基因数平均为1.7168，有效等位基因数平均为1.4013，Nei's遗传距离平均为0.2381，香农信息指数平均为0.3603，多态性位点百分比平均为71.67%。在物种水平上，遗传距离和香农信息指数值表明羌活具有中等水平的遗传变异。其中，pop35和pop27等种群显示出较高的遗传多样性指数，而pop5等种群遗传多样性较低。
3.2 遗传关系
基于Nei's遗传距离的UPGMA聚类分析将38个种群清晰地分为两大组：Cluster I（pop1-pop18）和Cluster II（pop19-pop38）。
主成分分析第一主成分也有效地区分了这两个簇。
地理上，遗传多样性较低的Cluster I主要分布在川西北高原南部，而遗传多样性较高的Cluster II主要分布在北部。所有种群间的基因流估计值为1.7346，两个簇间的基因流估计值为18.0461，均大于1，表明羌活存在高水平基因流，足以抵消遗传漂变引起的遗传分化。分子方差分析显示，总遗传变异的79.99%发生在种群内部，仅20.01%归因于种群间变异，这与从PopGene获得的遗传分化系数值一致，支持羌活的遗传分化主要发生在种群内部的结论。两个簇之间仅观察到2.77%的遗传变异，表明分化水平尚未达到亚种形成的程度。
3.3 种群进化历史分析
DIYABC分析确定情景1为最可能的进化历史，该情景认为Cluster I和Cluster II在大约14928年前从一个共同祖先种群同时分化。这个时间框架对应于末次盛冰期，表明羌活的分化与第四纪冰期旋回同时发生，并可能由其驱动，可能涉及短期种群扩张作为对变化冰川环境的适应。
3.4 遗传多样性与环境因子的相关性
相关性分析显示，遗传多样性参数与地理距离无显著相关性。然而，多个环境因子与遗传多样性显著相关。年均温与所有遗传多样性指数均呈正相关。纬度与香农信息指数呈显著正相关，而海拔与观测等位基因数、遗传距离和香农信息指数呈负相关。
Mantel检验显示，种群间的遗传分化与经度、海拔或地理距离无显著关联，但检测到显著但微弱的纬度隔离模式。对于气候变量，未检测到年均降水量、年均温或年均温度范围的显著环境隔离。
冗余分析进一步确认，在地理因子中，海拔是遗传变异的显著预测因子；在气候变量中，年均温能显著解释遗传变异。RDA双序图中箭头的相对长度也表明，海拔和年均温是影响羌活遗传多样性的主导因素。
讨论
评估药用植物种质资源的遗传多样性对于阐明物种濒危机制和制定有效保育策略以防止遗传资源丢失至关重要，也为育种计划中选择亲本材料以增强特定性状提供了宝贵见解。分子标记是研究植物遗传多样性的成熟工具。研究表明，ISSR标记因其高多态性和强区分能力而被认可。
遗传多样性参数是评估种群内遗传变异丰富度的关键指标。观测等位基因数反映了多态性程度，而有效等位基因数、Nei's遗传距离和香农信息指数的较高值与更大的遗传多样性和更强的环境适应潜力相关。通常认为，地方性、濒危和分布狭窄的物种往往表现出较低的遗传多样性。相比之下，先前对羌活的研究报告了相对较高的遗传多样性水平。
本研究揭示了羌活在青藏高原东南缘种群中具有中等水平的遗传多样性。研究发现遗传多样性与海拔、纬度和年均温相关，其中位于四川阿坝州海拔2500-3800米、纬度32–33°N的种群表现出更高的遗传多样性，表明在这些环境中具有更强的适应能力。这一发现为未来育种工作选择试验地点提供了理论基础。对于保育，建议对具有高遗传多样性的种群进行就地保护。那些面临重大环境威胁的种群可能受益于迁地保护，例如收集种子或根茎，以最大限度地保留遗传代表性。理解羌活的遗传多样性和环境适应性将有助于亲本材料和适宜育种环境的选择，从而加速育种进程。
