2. 利用植物DNA修复通路实现精准基因组编辑
CRISPR/Cas蛋白核酸酶源自多种细菌，其中化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）来源的SpCas9系统最为常用。该系统识别原间隔序列邻近基序（PAM，序列为5‘-NGG-3’），并在PAM上游3-4个碱基处切割DNA，产生平末端的双链断裂（DSBs）。随后，细胞的内源修复机制接管，产生不同的编辑结果：主要通过非同源末端连接（NHEJ）通路引入小的插入或缺失（InDels），导致基因破坏或敲除，这常被称为位点导向核酸酶1型（SDN1）；或者通过同源定向修复（HDR）通路，利用外源供体DNA模板产生精确的修饰。根据供体模板的设计，HDR可实现小的、靶向的核苷酸替换（SDN2），或促进更大DNA片段的插入或替换（SDN3）。这三种SDN框架构成了在功能基因组学和作物改良中应用CRISPR/Cas9的基础。
2.1 CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas系统根据效应复合物的组成分为I类和II类。II类系统利用单一的多结构域Cas效应蛋白（如Cas9、Cas12或Cas13），通过向导RNA复合物实现靶标识别和切割。其中，CRISPR/Cas9系统框架包括Pol III启动子、一个20bp的非重复区域（向导RNA）和Cas9核酸酶。Cas9蛋白识别PAM序列并在其上游切割，导致靶基因组预定位置的双链断裂和突变/缺失。具有更宽松PAM要求的工程化Cas9变体（如SpCas9-NG、xCas9、SpG、SpRY）扩大了谷物中的可编辑基因组空间，促进了复杂性状修饰的等位基因和调控区工程。
2.2 Cas12
Cas12a（原称Cpf1）是II类Cas系统V-A亚型中的单RNA引导核酸酶系统。与Cas9不同，它不需要反式激活CRISPR RNA（tracrRNA），并使用自身的向导RNA，编辑能力更强。Cas9识别NGG PAM并产生PAM位点上游的平末端断裂，而Cas12a系统识别TTTV PAM并在PAM位点下游产生交错断裂。Cas12a在修饰AT富集区域方面优于Cas9，且在NHEJ修复期间，未受影响的PAM位点可能对同一基因靶标执行反复编辑活动，从而提高了其靶向编辑效率。近期对Cas12a直系同源物和工程变体的优化，显著提高了其在谷物作物中对AT富集基因组的编辑效率、温度耐受性和多重编辑能力。
2.3 Cas13
Cas13系统可实现可编程的RNA靶向，主要在植物中用于病毒抗性和转录水平调控研究。虽然前景广阔，但Cas13在谷物中的应用大多仍处于实验阶段，尚未广泛用于稳定的农艺性状改良。
2.4 碱基编辑
植物碱基编辑的最新进展实现了谷物基因组中高效、可预测的核苷酸替换，允许在不诱导双链断裂的情况下精确调节酶活性和调控基序。改进的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE），包括进化的脱氨酶和优化的Cas变体，扩大了在水稻、小麦和大麦中进行性状工程的范围。这些发展为通过微调酶功能、胁迫信号和代谢通量（而非仅依赖基因敲除）来实现通路水平的性状改良提供了支持。RNA碱基编辑系统包括REPAIR（实现A到I（G）替换的可编程RNA编辑）和RESCUE（实现特异性C到U交换的RNA编辑）。碱基编辑可以通过引入提前终止密码子或触发转录本错误剪接来破坏植物基因。虽然相对较新，碱基编辑工具需要更多研究以实现颠换突变，并进一步提高其精度、准确性和可及性。
2.5 先导编辑
先导编辑通过实现可编程的“搜索并替换”基因组修饰，克服了无法在不诱导双链断裂或需要供体DNA模板的情况下，在预定义基因组位点引入精确核苷酸替换或小序列修饰的限制。先导编辑系统包含三个关键组件：（i）指定靶位点和所需编辑的先导编辑向导RNA（pegRNA），（ii）引入单链DNA缺口的Cas9切口酶，和（iii）将编辑序列直接复制到靶位点的逆转录酶。植物优化的先导编辑器架构（包括改进的pegRNA设计、增强的逆转录酶活性和优化的表达系统）方面的最新进展，已大幅提高了在单子叶作物中的编辑效率和可重复性。虽然先导编辑在产生转换突变方面通常效率低于碱基编辑，但它独特地实现了颠换替换和复杂核苷酸变化，这是CBE和ABE无法实现的。
3. 基因组编辑组件的递送
将基因组编辑组件递送到植物细胞中，对于没有高效转化机制的作物开发新性状仍是一个挑战。主要的递送方法局限于农杆菌（Agrobacterium）介导转化或基因枪轰击。此外，病毒介导、核糖核蛋白（RNP）递送、分生组织诱导、脂质体转染和聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化等方法也常用于植物基因组编辑。然而，递送效率高度依赖于多种变量，如外植体类型、农杆菌菌株、基因型、表达盒大小和培养基条件。
农杆菌介导转化（使用单个或多个二元载体）已被广泛用于将单个或多个基因表达盒递送到植物基因组中。该系统经济、技术简单，且在植物生物技术实验室中广泛可用。重要的是，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的是转移DNA（T-DNA）而非整个Ti质粒稳定整合到植物核基因组中。尽管有这些优势，农杆菌介导的递送存在一些局限性，包括在某些谷物基因型中宿主范围和转化效率受限、对转基因拷贝数和插入位点的精确控制能力有限，以及递送预组装的核糖核蛋白复合物或大型DNA构建体的灵活性降低。
作为体外转录本或核糖核蛋白递送的CRISPR/Cas试剂已实现了无DNA的基因组编辑。然而，这种方法可能产生同一基因的多个拷贝，导致不期望的表达变化。基因枪递送方法使用DNA包被的微弹来转染细胞。相比之下，聚乙二醇（PEG）用于原生质体转染，在细胞壁消化后将基因组编辑组件转入原生质体。原生质体转染的 fundamental 缺点是其无法应用于所有植物物种，尤其是单子叶植物。
纳米颗粒（NPs）作为递送载体等新技术已经获得发展势头，因为它们可以针对目标组织和生物体进行定制。带负电的gRNA分子与带正电的脂质瞬时结合。最近，核酸已被用作Cas9 RNP的聚合递送底物。细胞穿膜肽（CPPs）是可以轻松穿过细胞膜的短肽序列，它们可以与Cas9蛋白和gRNA偶联以提高递送效率。此外，核定位序列（NLSs）也在研究中，它们作为信号分子与细胞核内的转运蛋白偶联，可以将Cas9递送到细胞核中。
基于组织培养的方法，植物必须从改变的细胞/外植体中再生，因此非常耗时。此外，转化方法是基因型依赖性的，尚未为许多抗性作物物种建立可行的方案。因此，一种无需标准组织培养步骤和植株内方法（如花序浸染）的新方法被开发出来。通过表达发育调节因子（DR）基因，如WUSCHEL2（Wus2）和BABY BOOM（BBM），使用基因组编辑工具将基因编辑的体细胞重编程为分生组织细胞。DRs的组成型表达会导致生长异常，可以通过DRs的可诱导表达来规避。虽然从头诱导分生组织已在葡萄、马铃薯和番茄作物中使用，但其在具有可遗传突变的植物中的适用性尚未得到广泛研究。作为无组织培养技术，用表达SpCas9蛋白的病毒感染分生组织也已实现。
3.1 提高跨物种和基因型的转化效率
尽管基因组编辑已成为改良重要粮食作物的变革性方法，但许多实际障碍继续限制其广泛应用。与动物基因组编辑不同，植物基因组编辑需要将编辑试剂高效递送到植物细胞中，可靠地选择编辑事件，以及再生携带可遗传修饰的完整、可育植株。尽管CRISPR/Cas技术取得了重大进展，但对于许多作物（尤其是谷物）而言，转化和再生效率仍然高度依赖基因型和物种，因此是将其转化为育种流程的关键瓶颈。
最近的研究表明，发育调节因子（DR）基因（如BABY BOOM（BBM）和WUSCHEL2（WUS2））的瞬时表达，结合优化的植物激素方案，可以显著提高植物转化效率。这些调节因子的表达将体细胞重编程为具有分生组织能力，从而无需冗长的组织培养步骤即可实现从头芽形成和编辑植物的再生。虽然该策略在选定作物物种中显示出前景，但其在不同谷物基因型中的更广泛适用性仍然有限，需要进一步改进以确保发育稳定性、编辑的可遗传传播以及与先进基因组编辑模式（如碱基编辑和先导编辑）的兼容性。
总的来说，转化效率仍然是应用基因组编辑进行作物改良的主要限制因素。虽然瞬时转化系统足以进行功能基因组学研究，但能够实现精确、单拷贝整合和一致再生的稳定转化对于育种导向的应用至关重要。
4. 使用CRISPR/Cas9方法对谷物进行精确基因组编辑
使用CRISPR/Cas9系统对谷物进行精确基因组编辑已迅速发展，为靶向性状改良提供了超越常规育种限制的机会。在水稻、小麦、大麦和玉米中，CRISPR/Cas9已被用于增强产量相关性状、改善籽粒品质并赋予对生物和非生物胁迫的耐受性。最近基于CRISPR的基因组编辑进展已将谷物改良从单基因诱变转向通路信息化的精准育种，整合多重编辑、调控区工程以及高分辨率碱基和先导编辑方法来调控复杂的农艺性状。
4.1 籽粒产量构成与源库调节
通过CRISPR/Cas9靶向改良产量的基因通常编码控制关键代谢节点而非产量本身的酶或调节因子。只有当此类编辑将碳通量、激素周转或同化物分配转向有利于生殖生长时，才会实现产量增益。
在代谢水平上，CRISPR介导的产量改良主要是通过重编程激素调节的酶促过程来实现的，这些过程控制分生组织活性和同化物分配。例如，编辑细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CKX）基因可减少细胞分裂素降解，增加花序分生组织中的活性细胞分裂素库。这种酶促转变提高了细胞分裂速率并延长了分生组织活性，从而增加了籽粒数。同样，靶向修饰赤霉素生物合成基因（如GA20-氧化酶）会改变赤霉素通路中的通量，减少过度的茎秆伸长，并将碳资源重新导向生殖组织。这些激素介导的代谢调整共同改善了源库平衡和籽粒产量潜力。
谷物的籽粒产量是一个复杂的数量性状，受到多个遗传组分、调控网络和环境相互作用的影啊，使其成为多重和调控区基因组编辑而非单基因修饰的理想靶标。负调控因子编码基因可以被敲除或通过修饰其上游启动子区域来下调表达。使用CRISPR/Cas9同时敲除多个负调控因子，如粒宽2（GW2）、粒宽5（GW5）和千粒重6（TGW6），显著提高了水稻的籽粒产量。最近的多重CRISPR/Cas9研究表明，协调编辑控制籽粒大小、分生组织活性和激素周转的负调控因子，可以通过重编程源库关系而非通过单基因效应来提高产量。
在顺式调控区域，启动子编辑被证明是改良谷物作物产量相关性状的一种有前途的方法。CRISPR是改变启动子区域以微调基因表达的完美工具。对编码WD40、KRN2和OsKRN2的基因在玉米和水稻中进行编辑，导致籽粒数和穗行数增加，据报道玉米产量增益高达10%，水稻高达8%。这项研究采用CRISPR敲除技术在KRN2（穗行数2）基因的非编码上游区域内创建变异。已知控制籽粒数和穗分枝的负调控因子（如KRN2）是作物改良的潜在靶标。在玉米中，与CLAVATA-WUSCHEL通路相关的CLR基因的启动子区域，通过使用CRISPR/Cas9创建弱等位基因来增加产量相关性状。
4.2 作为产量稳定性状的耐旱性
耐旱性本身不是增产性状，而是在水分有限条件下保持生产力的关键稳产属性。在谷物作物中，干旱主要通过破坏光合作用、削弱碳同化、加速衰老以及限制向发育籽粒的同化物运输来降低产量。CRISPR/Cas介导的基因组编辑使得能够精确修改干旱响应代谢和信号通路中的关键调控节点，从而减轻这些负面影响并在不同环境下稳定产量。
在酶和代谢水平上，许多基于CRISPR的耐旱性策略靶向脱落酸（ABA）信号通路，该通路整合水分胁迫感知与下游生理响应。编辑属于PYR/PYL家族的ABA受体基因，改变了ABA、蛋白磷酸酶2C（PP2C）和SNF1相关蛋白激酶（SnRK2s）之间的相互作用。这些修饰微调了气孔开度调节，减少了蒸腾失水，同时保持了足够的CO2流入用于光合作用。同时，下游抗氧化酶和渗透保护剂生物合成通路的激活减少了干旱胁迫下的氧化损伤，保持了细胞代谢完整性。
CRISPR介导的干旱响应转录因子和负调控因子的修饰，通过维持胁迫期间碳固定和同化物流动，进一步促进了产量稳定性。例如，编辑抑制胁迫响应代谢通路的基因，增强了参与渗透调节、活性氧清除和细胞能量平衡的酶的表达。这些变化维持了光合效率并延迟了胁迫诱导的衰老，确保持续的碳水化合物可用于籽粒灌浆。
重要的是，耐旱性编辑通过稳定源库关系而非在最佳条件下提高产量潜力来间接支持产量。通过保护光合活性、维持叶片功能和持续向生殖组织运输同化物，CRISPR工程化的耐旱品系在缺水条件下表现出减少的产量损失。
4.3 营养强化
通过CRISPR/Cas9改良的籽粒品质性状与籽粒灌浆期间淀粉生物合成和碳分配的酶促步骤直接相关。靶向编辑淀粉分支酶（SBEI和SBEIIb）改变了支链淀粉的分支程度，将碳通量转向增加直链淀粉和抗性淀粉的形成（代表SDN-2型修饰）。同样，修饰颗粒结合淀粉合酶（GBSS/Waxy）基因影响葡聚糖延伸动力学，从而影响淀粉结构、籽粒密度和最终用途品质。这些酶促修饰不仅提高了营养价值，还影响了粒重和灌浆效率，证明了品质和产量性状的相互关联性。
改善食物品质性状，如营养价值和储藏品质，可以有效地使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑进行靶向改良。靶向修饰淀粉生物合成基因，包括Waxy和淀粉分支酶，已经使开发出具有改变直链淀粉组成和增强抗性淀粉含量的谷物品系成为可能。最近对水稻淀粉分支酶基因的多重CRISPR/Cas9编辑显著提高了抗性淀粉水平，证明了精确代谢重编程胚乳淀粉生物合成具有营养益处。同样，在玉米中CRISPR/Cas9介导的淀粉分支酶编辑产生了高直链淀粉和抗性淀粉表型，且不影响农艺性能，突显了基因组编辑用于谷物营养改良的转化潜力。除了淀粉品质，木质纤维素组成也成为价值提升的靶标。在水稻中靶向CRISPR/Cas9诱导的肉桂醇脱氢酶基因（OsCAD2）突变降低了木质纤维素顽固性，从而提高了生物质糖化效率并扩大了下游利用潜力。
4.4 生物胁迫抗性
生物胁迫抗性是CRISPR/Cas9在谷物作物中最成功的应用之一，特别是通过编辑感病（S）基因和病原体效应子结合位点。与传统抗性育种不同，基因组编辑允许精确破坏宿主感病通路，同时最小化产量损失。最近的研究越来越多地将疾病抗性编辑与产量和结构相关性状结合起来，强调了综合性状改良而非孤立抗性工程的重要性。先进的基于CRISPR的策略，包括多重和精确基因组编辑，能够靶向修饰宿主感病和抗性通路，促进持久抗病性，同时最小化相关的产量损失。
编辑疾病感病（S）基因已成为赋予谷物作物对细菌和真菌病原体持久抗性的最有效基因组编辑策略之一。最近基于CRISPR/Cas的研究表明，靶向修饰宿主感病通路可以阻断病原体对宿主代谢的利用，同时最小化与组成型防御激活相关的权衡。在水稻中，精确编辑SWEET蔗糖转运蛋白基因及其启动子区域已被证明可以破坏病原体诱导的糖外流，从而限制黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）的碳可用性，并增强对白叶枯病的抗性，且无重大产量损失。这些研究证实，通过宿主基因编辑使病原体代谢匮乏代表了一种强大的抗性机制。
类似地，CRISPR介导的MLO感病基因编辑仍然是小麦和其他谷物白粉病抗性的基石策略。最近的工作通过将TaMLO敲除与补偿性代谢或转运蛋白基因调控相结合，以减轻传统上与mlo基抗性相关的多效性效应，从而改进了这种方法。特别是，多重CRISPR策略通过异位调节液泡糖转运蛋白或微调防御相关的碳水化合物分配，成功地将疾病抗性与生长损失解耦，产生了具有稳定产量表现的抗白粉病小麦品系。除了感病转运蛋白，基于CRISPR/Cas9破坏免疫负调控因子（包括乙烯响应转录因子和其他信号抑制因子）进一步扩展了谷物抗病工程的工具箱。最近的水稻研究表明，编辑防御信号网络中的转录抑制因子通过加强基础免疫同时保持光合和代谢效率来增强稻瘟病抗性。
从代谢角度来看，通过CRISPR编辑实现的生物胁迫抗性通过防止病原体诱导的宿主碳资源转移来保护产量。编辑感病基因（如SWEET糖转运蛋白）破坏了病原体触发的蔗糖从宿主细胞外流，从而保留碳水化合物用于宿主代谢和籽粒发育。同样，敲除MLO基因在不大量激活防御相关能量消耗的情况下降低了病原体相容性。这些修饰说明了抗病性状如何保持代谢效率和碳可用性，间接地在病原体压力下维持产量。
宿主感病因子的靶向编辑也已成功应用于赋予谷物作物对病毒病原体的抗性。在水稻中，使用CRISPR/Cas9靶向编辑起始因子4γ（eIF4G）基因的感病（S）型等位基因。使用CRISPR/Cas9在水稻品种中产生的新eIF4G等位基因降低了对由水稻东格鲁球状病毒引起的水稻东格鲁病（RTD）的感病性。这项研究是通过靶向编辑S基因来改善谷物作物病毒抗性的恰当例子。在独脚金（Striga hermonthica）寄生杂草抗性方面，靶向编辑LGS1基因座内的SbCCD7、SbCCD8、SbMAX1和一个SbDUF结构域基因，已导致开发出抗性高粱品系。
4.5 CRISPR介导的谷物性状改良的酶和通路水平基础
复杂农艺性状（如产量、胁迫耐受性和籽粒品质）的改良最终取决于酶活性和代谢通路的修饰。CRISPR/Cas介导的基因组编辑能够精确操纵编码酶、调节蛋白和转录控制器的基因，从而重塑谷物中的代谢通量和生理过程。
4.5.1 淀粉生物合成与碳分配
谷物籽粒产量和品质受到淀粉生物合成酶的强烈影响，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉分支酶（SBEI和SBEII）、颗粒结合淀粉合酶（GBSS/Waxy）和可溶性淀粉合酶。CRISPR介导的Waxy（GBSS）编辑通过限制葡聚糖链延伸来减少直链淀粉合成，改变淀粉结构并改善蒸煮品质而不影响产量。类似地
