《Virulence》：Substrate secretion by the different EHEC secretion systems during its interaction with epithelial cells
引言
肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）是一种可引起严重食源性疾病的病原体，属于产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing E. coli, STEC）群。其O157:H7血清型是导致人类疾病的主要原因。EHEC是一种胞外病原体，特征是在定植胃肠道后形成附着/抹平（Attaching and Effacing, A/E）损伤。EHEC感染临床表现多样，从无症状到非血性腹泻或自限性出血性结肠炎，约5-7%的病例可并发溶血性尿毒综合征，部分可致命。由于其低感染剂量（<100个细菌）即可致病的能力，且全球范围内暴发持续增加，EHEC感染已成为严重的公共卫生问题。
EHEC编码多种毒力因子，其中许多位于被称为O岛（O island, OI）的基因组岛上。EHEC拥有177个O岛，包含1387个基因，但其中仅有约5%的基因与毒力相关。两个关键的毒力因子——志贺毒素（位于OI-45）和III型分泌系统（Type three secretion system, T3SS，位于OI-148，也是肠细胞脱落位点的一部分）——就编码在这些O岛上。此外，关键毒力因子还位于92 kb的质粒pO157上，该质粒编码了三种分泌系统（T1SS、T2SS和T5aSS）。染色体上还有一个与VI型分泌系统相关的致病岛，但该系统的表达在体外条件下未被检测到。尽管如此，目前对于这五种分泌系统已知的分泌底物仍然有限。
分泌系统是专门用于分泌和/或转运蛋白质（底物）的纳米机器，确保在感染过程中递送毒力因子。在EHEC中，已有39种效应蛋白被实验证实通过T3SS分泌，使其成为拥有最广泛T3SS相关蛋白库的A/E病原体。值得注意的是，这些效应子大多编码在λ样前噬菌体上，凸显了噬菌体对EHEC毒力因子多样性的贡献。与其他分泌系统相比，T3SS得到了较为深入的研究。已有研究表明，与其他EHEC分泌系统相关的毒力因子涉及细胞裂解（HlyA-T1SS）、粘蛋白降解（StcE-T2SS）、免疫反应调节（StcE-T2SS， EspP-T5aSS， KatN-T6SS）以及凝血因子降解（EspP-T5aSS）。这些发现强烈暗示这些分泌系统在EHEC致病过程中扮演着重要角色。
尽管T3SS分泌的广泛蛋白库已被证明是EHEC定植的重要因素，但其他分泌系统也可能在致病过程中发挥作用，尤其是考虑到它们的功能或激活需要消耗大量的细菌能量。因此，这些大分子复合物很可能被用于分泌多个底物。然而，目前文献报道的矛盾之处在于，T1SS仅报道了一个底物HlyA，而T2SS仅报道了两个底物StcE和YodA。事实上，对人类致病菌的蛋白质组学分析已经扩展了T2SS分泌的底物库，包括参与生物膜形成、免疫调节、粘蛋白酶、脂肪酶、粘附素和毒素等多种功能的蛋白。此外，在EHEC的替代模型*Citrobacter rodentium*中，T2SS的缺失最近被证明会导致定植缺陷。另一方面，这些分泌底物之间可能存在协作，例如T3SS分泌的Tir与T5eSS分泌的紧密素在细菌粘附宿主细胞过程中的相互作用。此外，T5aSS分泌的EspP可以切割T1SS分泌的HlyA，从而抑制细胞裂解，这提示了EHEC可能通过其分泌的毒力因子进行调控。有趣的是，虽然EHEC的五种分泌系统的一些底物已被描述，但它们在感染过程中如何协同参与与上皮细胞的相互作用仍属未知。
材料与方法
菌株与质粒：本研究使用了EHEC EDL933菌株及其等基因突变株ΔescN(ΔT3SS)和ΔespP(ΔT5aSS)，由José Luis Puente博士和Eric Oswald博士惠赠。所有菌株常规在LB培养基中培养，必要时添加氨苄青霉素、卡那霉素或氯霉素。实验中使用DMEM培养基或改良的M9培养基。
突变体构建：通过同源重组方法，用卡那霉素抗性盒替换结构基因hlyD (T1SS)、etpC(T2SS)、escN(T3SS)或espP(T5SS)，构建了相应的分泌系统突变体。
克隆与蛋白表达纯化：从质粒pO157或EHEC EDL933裂解物中扩增hlyA、stcE、espP和espB基因，克隆到表达载体pTrcHis2B或pRSET A中，转化至E. coliTOP10或BL21进行表达。使用镍柱在变性条件下纯化重组蛋白。
多克隆抗体制备：用纯化的HlyA、StcE、EspB和EspP蛋白免疫BALB/cJ小鼠，制备针对这些蛋白的多克隆抗体，用于后续的免疫印迹分析。
蛋白分泌实验：
- 1.
不同分泌系统的激活：为了寻找能增强EHEC大多数毒力因子分泌的合适培养基，研究者测试了不同的培养基配方来激活EHEC并诱导不同SS的底物分泌。使用了针对各SS特异性底物的抗体。激活培养基包括DMEM高葡萄糖、DMEM低葡萄糖或改良M9。激活后，将菌液接种到不同配比的分泌培养基中。
- 2.
野生型与突变株的蛋白分泌比较：所有菌株在MM9中激活后，重悬于不含补充剂的DMEMHG中。为了比较有无细胞条件下的分泌蛋白，将细菌接种到60-mm培养皿中，在有无HT-29上皮细胞的情况下共培养。收集上清，进行蛋白沉淀和免疫印迹分析。
细胞培养与感染模型：使用人上皮细胞HT-29，在含10%胎牛血清的DMEM中培养。用WT-EHEC或其等基因突变体以感染复数10感染汇合的HT-29细胞。
分泌组LC-MS/MS分析：收集WT-EHEC、ΔT1SS、ΔT2SS和ΔT3SS菌株在有无细胞条件下的上清样本。使用截留分子量为10 kDa的超滤管浓缩蛋白，通过甲醇-氯仿沉淀法准备样品，并用胰蛋白酶消化。肽段通过纳米液相色谱分离，并在Synapt G2-Si质谱仪上使用HDMSE模式进行质谱分析。
质谱数据分析：使用Progenesis QI for Proteomics软件对质谱数据进行绝对定量分析，比对EHEC EDL933数据库。蛋白质鉴定标准包括：胰蛋白酶酶切、允许最多一个漏切位点、固定修饰为半胱氨酸烷基化、可变修饰为甲硫氨酸氧化等。接受标准为肽段和碎片离子的质量误差分别在10 ppm和20 ppm以内，错误发现率≤1%。
生物信息学分析：使用PSORTb v3.0.3预测蛋白质亚细胞定位，使用SignalP v6.0识别信号肽，使用SecretomeP v2.0识别非经典分泌蛋白。使用BastionHub软件的BastionX模块预测新的潜在SS底物。使用R语言的VennDiagram包绘制韦恩图。
统计学分析：使用GraphPad Prism v10.0软件进行统计分析。结果以至少三次独立实验的平均值±标准差表示。使用Student's t检验或ANOVA确定统计显著性，p值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
EHEC根据激活和分泌培养基分泌蛋白
为了找到能增加EHEC大多数毒力因子分泌的合适培养基，研究者测试了不同的培养基配方。结果显示，T1SS、T3SS和T5aSS的分泌在DMEM低葡萄糖中似乎比在高葡萄糖中更高，但仅T1SS的差异达到统计学显著性。T2SS（StcE）和T3SS（Tir、EspA和EspB）的底物分泌在MM9培养基中达到最高。然而，DMEM低葡萄糖或MM9培养基均不支持上皮细胞的有效生长。因此，研究者采用了MM9激活后，在含有任何真核细胞培养基（如DMEM高葡萄糖）的条件下进行分泌实验的方案，该条件在后续实验中被采用。制备的抗体能特异性识别EHEC上清中四种SS分泌的六种标志性蛋白。
EHEC在与上皮细胞接触时增加通过T1SS、T2SS、T3SS和T5SS的蛋白分泌
为了表征感染过程中的不同SS，用WT-EHEC或ΔT3SS以MOI 10感染HT-29细胞3小时。与无细胞培养相比，在上皮细胞存在的情况下，EHEC显著增加了所有测试SS的蛋白分泌：HlyA (T1SS)、StcE (T2SS)和EspP (T5aSS)约增加四倍，Tir和EspB增加六倍，EspA增加两倍。正如预期，在ΔT3SS突变株的上清中，无论有无上皮细胞，均未检测到T3SS效应子。然而，在上皮细胞存在时，ΔT3SS中T1SS、T2SS和T5aSS的底物分泌与WT-EHEC一样增加。这些数据表明，SSs在上皮细胞感染过程中被增强，并且至少T3SS突变不影响T1SS、T2SS或T5aSS特异性底物的分泌。
通过不同EHEC分泌系统的分泌层级
为了研究在EHEC-上皮细胞相互作用过程中哪些SS首先被激活，以及不同SS的分泌层级，研究者进行了分泌动力学实验。在有无HT-29细胞的情况下，从20分钟到180分钟不同时间点收集上清进行分析。结果显示，无论是在有还是无上皮细胞的情况下，T3SS都是第一个被激活的系统。第二个被激活的系统是T1SS，而T2SS和T5aSS最后被激活。在上皮细胞感染期间，除T3SS在感染20分钟时即被激活外，所有SS在40分钟时均被激活。因此，T2SS和T5aSS的底物分泌在上皮细胞存在时提前了20分钟。在所有情况下，无论有无上皮细胞，上清中底物浓度的增加都是时间依赖性的，且在细胞存在时增加最高，其中T3SS和T2SS底物的检测浓度最高。
EHEC以及T1SS、T2SS和T3SS突变株分泌的蛋白质
由于EHEC-上皮细胞的相互作用改变了三种类型SS的特定底物分泌谱，研究者分析了WT-EHEC、ΔT1SS、ΔT2SS和ΔT3SS在有无上皮细胞条件下的分泌组。排除了T5SS和T6SS突变体，因为T5SS底物是单独分泌的，而T6SS在EHEC体外不表达。通过LC-MS/MS分析菌株上清并与EHEC EDL933数据库比对发现，WT-EHEC在感染上皮细胞时改变了其分泌谱。在无细胞条件下，WT-EHEC分泌了451种已鉴定蛋白，而在有细胞条件下仅分泌了157种。这种分泌蛋白的减少在ΔT1SS、ΔT2SS和ΔT3SS中也被观察到，在ΔT2SS中尤为明显。
通过比较WT-EHEC与各突变株，发现不同突变对共享蛋白比例的影响不同。在无细胞条件下，ΔT3SS与WT-EHEC共享的分泌蛋白比例最小，而ΔT1SS和ΔT2SS共享比例较高。在有细胞条件下，这些比例发生变化，ΔT3SS再次影响了最大数量的分泌蛋白，而ΔT2SS对分泌蛋白数量的影响变得小于ΔT1SS。韦恩图分析表明，不同SS突变体之间存在复杂的蛋白质分泌网络相互影响。
WT-EHEC与ΔT1SS的差异蛋白分泌
在无上皮细胞条件下，与WT-EHEC相比，ΔT1SS有许多蛋白质的分泌发生了改变：51种蛋白显著增加，17种减少。在增加最多的十种蛋白质中，部分含有信号肽和非经典分泌预测。减少最多的十种蛋白质中，大多数被PSORTb归类为胞质蛋白。值得注意的是，T1SS的缺失至少影响了一种已知的T5aSS分泌蛋白EspP，以及其他参与其他SS的蛋白质。有趣的是，在上皮细胞存在的情况下，ΔT1SS与WT-EHEC相比，蛋白分泌谱完全改变，之前无细胞条件下减少或增加的分泌蛋白均未显示显著差异，表明上皮细胞的存在产生了补偿表型。
从所有差异分泌蛋白中，在无细胞条件下，ΔT1SS与WT-EHEC相比，有35种具有已知输出信号的蛋白发生差异分泌，其中绝大多数似乎具有周质中间体。而在有细胞条件下，具有已知输出信号的39种蛋白中，没有一种出现增加或减少，表明细胞的存在补偿了无细胞条件下观察到的蛋白增减。
WT-EHEC与ΔT2SS的差异蛋白分泌
在无细胞条件下，与WT-EHEC相比，ΔT2SS有27种蛋白显著增加，28种减少。增加最多的蛋白质中，部分含有信号肽。减少最多的蛋白质中，包含了已知的T2SS、T3SS和T5aSS底物。显然，T2SS缺失至少影响了四种已知底物，以及其他参与SSs的蛋白。
与ΔT1SS不同，在有上皮细胞条件下，ΔT2SS与WT-EHEC相比仍有31种蛋白差异分泌。细胞的存在并没有补偿在无细胞条件下观察到的蛋白增减。从所有差异分泌蛋白来看，在无细胞条件下，ΔT2SS与WT-EHEC相比，有29种具有已知输出信号的蛋白发生差异分泌，其中绝大多数具有周质中间体。在有细胞条件下，20种具有已知输出信号的蛋白发生差异分泌。
WT-EHEC与ΔT3SS的差异蛋白分泌
在无细胞条件下，与WT-EHEC相比，ΔT3SS有7种蛋白显著增加，27种减少。增加最多的蛋白质中部分含有信号肽。减少最多的蛋白质中，部分仅含有非经典分泌信号。显然，T3SS缺失对蛋白分泌的影响大于T1SS或T2SS突变，重要的是，它影响了EspP (T5aSS)和NlpB的分泌。
与ΔT1SS不同，在有细胞条件下，ΔT3SS分泌的蛋白数量比无细胞条件下更多，主要是增加的蛋白。从所有差异分泌蛋白来看，在无细胞条件下，ΔT3SS与WT-EHEC相比，仅有15种具有已知输出信号的蛋白发生差异分泌，且大多数含有NCS。在有细胞条件下，23种具有已知输出信号的蛋白发生差异分泌。
通过T1SS、T2SS和T3SS分泌的潜在新底物的检测
为了检测不同SS可能的新底物，研究者分析了在WT-EHEC上清中鉴定到但在各SS突变株中缺失的蛋白质，并根据其具有信号序列、亚细胞定位非胞质、不包含在已知SS底物数据库中、在突变株中未增加、以及BastionHub预测为潜在分泌底物等特征进行筛选。由此鉴定出16种EHEC或其突变株分泌的潜在新底物：9种在无细胞条件下分泌，7种在有细胞条件下分泌。有趣的是，一种功能未知的蛋白Z2083未在ΔT1SS和ΔT3SS的上清中检出，但其被BastionHub预测为T3SS底物的分数高于T1SS，这提示T3SS和T1SS在Z2083分泌中存在某种关联。大多数推定的新底物被预测为T2SS底物，其余为T3SS底物。值得注意的是，近50%的蛋白功能未知，且其中多个编码于噬菌体上，并位于与毒力相关的O岛上。
EHEC、ΔT1SS、ΔT2SS和ΔT3SS分泌系统的动态
对WT-EHEC及其突变株分泌的总蛋白进行主成分分析显示，无论突变如何，EHEC分泌了542种蛋白。无细胞条件下分泌了500种蛋白，有上皮细胞条件下分泌了258种，共享216种。因此，无细胞条件下有284种差异分泌蛋白，而有细胞条件下仅有42种。主成分分析将WT-EHEC与其突变株的分泌谱清晰区分开来。在无细胞条件下，ΔT2SS和ΔT3SS的分泌谱聚集在一起，而ΔT1SS的分泌谱略微分离。在有细胞条件下，PCA结果不同，WT-EHEC和ΔT1SS聚为一类，ΔT2SS和ΔT3SS各自成簇。
从216种共享分泌蛋白中，有49种在WT-EHEC及其突变株之间存在差异分泌。其中大多数是胞质蛋白，其余为胞外、外膜、周质或未知定位蛋白。显然，大多数这些分泌蛋白在无细胞条件下减少，而在有细胞条件下增加。
EHEC、ΔT1SS、ΔT2SS和ΔT3SS上清中丰富蛋白的鉴定
通过定量质谱分析上清中蛋白的丰度。在无细胞条件下，WT-EHEC上清中丰度最高的十种蛋白均具有信号序列。从构建的已知SS结构组分和底物数据库中，可以观察到代表性毒力因子的丰度排名。在有细胞条件下，WT-EHEC上清中丰度最高的十种蛋白的谱系发生变化，并非所有蛋白都具有信号序列。各突变株在有无细胞条件下的蛋白丰度排名也发生了相应变化，反映了不同分泌系统缺失对整体分泌谱的影响。
一个SS的突变影响其他SS某些效应子的分泌
为了验证蛋白质组学检测到的SSs之间可能存在的相互依存性，研究者通过免疫印迹比较了WT-EHEC与各突变株对特定SS底物的分泌。正如预期，HlyA在ΔT1SS上清中不分泌，但在ΔT3SS和ΔT5SS中的分泌与WT-EHEC相似。然而，ΔT2SS导致HlyA的分泌强烈增加。StcE在ΔT2SS中不分泌，在WT-EHEC、ΔT1SS和ΔT5SS中分泌水平相似，但在ΔT3SS中显著降低。对于T3SS效应子，Tir在除ΔT3SS外的所有突变株中分泌水平与WT-EHEC相似；EspA在WT-EHEC和ΔT5SS中相似，但在ΔT1SS和ΔT2SS中略有下降；最显著的是EspB，其在所有突变株中的分泌均较WT-EHEC显著降低。对于T5aSS，ΔT1SS分泌的EspP水平与WT-EHEC相似，但ΔT3SS上清中EspP的分泌急剧下降，其程度低于ΔT2SS。
值得注意的是，验证了蛋白质组学结果，在有细胞存在的情况下，所有突变株中StcE、EspA、EspB或EspP分泌的差异得到了补偿，其分泌水平与WT-EHEC相似。然而，T1SS和T2SS之间关于HlyA分泌的相互依存关系仍然存在，因为T2SS的突变导致HlyA分泌强烈增加。
讨论
多个底物通过分泌系统分泌，这些蛋白在胞外或真核细胞内发挥作用。由于细菌与真核细胞的相互作用需要在特定时间和空间分泌多种蛋白质，理解EHEC如何整合这些不同的SSs将有助于确定它们在感染过程中的相关性。本研究优化了EHEC五种SS中四种（T6SS在体外条件下无活性）的蛋白分泌条件。研究者结合了MM9等培养基来激活SSs，并使用DMEM培养基促进蛋白分泌到胞外。值得注意的是，在上皮细胞存在的情况下，EHEC通过不同SS增加了特定蛋白质的分泌，其中许多是如免疫印迹检测到的特异性毒力因子。本研究首次报道了在上皮细胞感染过程中，EHEC通过四种SS分泌毒力因子遵循一种分泌层级。对EHEC及其不同SS突变株在有无细胞条件下分泌组的分析显示了几个重要发现：EHEC在细胞存在时显著增加了特定底物的丰度；某个特定SS的缺失会全局性地影响底物分泌以及其他SS的底物分泌；在某些情况下，上皮细胞的存在减弱了在无细胞条件下观察到的由任何SS突变引起的影响；生物信息学分析使我们能够鉴定出每个SS的新的潜在底物。免疫印迹验证分析表明，SSs之间的底物分泌存在相互依存关系。
EHEC通过其全局调节因子Ler，根据培养基中氧气和营养物质的可用性来策略性地调控T3SS的表达。本研究表明，与T3SS相关的四种SS底物的分泌在含有最低盐分和低葡萄糖的MM9培养基中被优化。此外，激活后，在用于真核细胞的培养基中孵育感染细胞的EHEC，可以优化底物分泌。因此，在存在或不存在上皮细胞的情况下，使用MM9进行激活并在DMEM高葡萄糖中进行分泌实验，是蛋白分泌和上皮细胞保存的最佳折衷方案。在缺乏钙的M9培养基中，EHEC主要分泌效应子，而在含有丙酮酸盐的DMEM低葡萄糖培养基中，LEE基因转录和转位子EspB的分泌增加。有趣的是，如果EHEC一直保持在MM9培养基中，T2SS和T3SS底物的分泌与DMEM低/高葡萄糖相比显著增加，这使我们的MM9成为研究这两种SS分泌的最佳培养基。在DMEM低葡萄糖中，HlyA的分泌比传统上用于T3SS蛋白分泌的DMEM高葡萄糖有所改善。这与Ler转录在低葡萄糖培养基中被激活的事实一致。此外，Ler不仅正向调节T3SS的表达，还促进HlyA-T1SS和StcE-T2SS的表达。与T3SS不同，T1SS在MM9培养基中不能高效运作，这表明T1SS需要低葡萄糖水平和DMEM培养基中存在的营养物质才能有效运作。本研究配制的MM9培养基含有丙酮酸盐作为葡萄糖的替代碳源。该培养基不仅优化了T3SS的分泌，也优化了T2SS的分泌。这与最近的报告一致，该报告显示碳代谢的主调节因子PdhR是响应培养基中丙酮酸盐水平的LEE激活剂。由于Ler也促进T2SS的表达，这两种SS很可能在感染过程中协调工作。
我们的蛋白质组学数据显示，EHEC通过其四种不同的SS在有无真核细胞条件下分泌蛋白质。然而，当EHEC感染上皮细胞时，尽管分泌蛋白总数减少，但通过T1SS、T2SS、T2SS、T3SS和T5SS的特定底物分泌却增加。这些数据与免疫印迹检测到的各SS特异性底物分泌增加一致。这些发现很有趣，因为那些插入宿主细胞膜或转运到细胞内的蛋白质可能增加得更多。这种在宿主细胞存在下蛋白分泌的强烈增加可能与之前的报告有关，即真核细胞质膜的成分有助于发病机制。真核细胞上清在3小时相互作用时似乎并未改变分泌的细菌效应子。另一方面，宿主细胞鞘脂是贯穿T3SS和志贺毒素发病机制的介质。这些数据表明，EHEC可能感知宿主膜成分以刺激四种不同SS的蛋白分泌。这个想法很重要，支持了这两个界之间存在高度的细胞通讯。
通过对WT-EHEC及其T1SS、T2SS和T3SS突变株在有无细胞条件下分泌蛋白质的比较分析，我们发现任何SS的缺失都会导致EHEC分泌谱的全局变化。有趣的是，在无细胞条件下，ΔT3SS与WT-EHEC共享的分泌蛋白百分比最小，而ΔT1SS和ΔT2SS共享的百分比更高。ΔT3SS分泌谱的这种显著差异可以解释为什么该SS的突变几乎消除了对上皮细胞的所有形态学影响。此外，EHEC拥有更广泛的分泌效应子库，并且一致地，在有细胞存在时，ΔT3SS分泌的蛋白质数量比WT-EHEC更多，但底物谱不同。有趣的是，目前仅有一个底物被实验证实由T1SS分泌，而ΔT1SS与WT-EHEC共享了95%的蛋白分泌，这表明EHEC可能只有少数由T1SS分泌的底物。尽管在ΔT2SS中，上清中鉴定到的蛋白质有91%与WT-EHEC共享，但其上清中鉴定到的蛋白质总数较少。相比之下，目前在EHEC中仅实验发现了两种与其上清相关的蛋白质，分别与粘蛋白降解和EHEC粘附上皮细胞有关。然而，T2SS在A/E病原体中保守存在。同样，在EPEC中仅鉴定出一种底物，而生物信息学分析在C. rodentiumT2SS中鉴定出22种底物，这些底物对定植至关重要。因此我们推测，EHEC中可能还有目前未知的额外底物通过T2SS分泌。ΔT3SS上清显示EspB、EspD、EspA和Map的分泌减少。Tir和EspF也被鉴定出来，但与WT-EHEC上清相比没有显示出显著差异。因此，我们的培养基配方可能促进了转位子的分泌，而经典的DMEM培养基则优先促进转位子分泌。蛋白质组学数据与免疫印迹结果一致，显示ΔT3SS不分泌EspB、EspA和Tir。此外，我们证实该突变体导致EspP分泌减少，并且令人惊讶的是，StcE分泌也减少，尽管这在蛋白质组学中未被检测到。尽管如此，这些发现支持了我们关于T2SS、T3SS和T5SS之间存在相互依存关系的假设。
在蛋白质组学数据中，未观察到ΔT1SS和WT-EHEC之间HlyA分泌的显著差异，这出乎意料。然而，已知EHEC会产生含有HlyA的外膜囊泡。正如预期，在免疫印迹中未检测到HlyA分泌，在这些实验中上清蛋白使用三氯乙酸沉淀，而用于蛋白质组学分析的上清通过过滤浓缩。相反，在比较WT-EHEC和ΔT2SS的分泌组时，无论在有无上皮细胞条件下，StcE都急剧减少。值得注意的是，T2SS的缺失改变了T3SS底物如EspB和Map在无细胞条件下的分泌，以及EspB和EspA在有细胞条件下的分泌。ΔT2SS还影响了上清中Stx2B和EspP的存在。这些数据与免疫印迹发现一致；ΔT2SS改变了EspB、EspA和EspP的分泌。然而，在有细胞存在的情况下，除了StcE外，这些差异变得不显著。因此，除了Ler作为StcE-T2SS分泌的正向调节因子外，我们的数据报告了T2SS在T3SS底物分泌中的重要参与。我们还通过免疫印迹观察到，在有无细胞条件下，ΔT2S
