《Virulence》：Analyses of receptor binding specificity of highly pathogenic avian influenza a (H5N1) viruses isolated from felines in South Korea, 2023
引言
高致病性禽流感（HPAI）是一种主要影响禽类的传染病，但其某些亚型可跨越物种屏障感染哺乳动物，包括人类，引发严重的公共卫生担忧。在目前流行的HPAI病毒中，属于2.3.4.4b进化支的H5N1亚型已成为全球优势毒株，除野生鸟类外，已确认可溢出感染哺乳动物。2023年7月，韩国首次报道了两起由HPAI H5N1病毒引起的猫群致死性聚集感染事件（冠岳区和龙山区）。对分离株的表征显示其在哺乳动物中具有高致病性和高效的接触传播能力，凸显了评估其人畜共患潜力的必要性。流感病毒感染宿主细胞是通过其包膜糖蛋白血凝素（Hemagglutinin, HA）与宿主细胞表面的末端唾液酸（Sialic Acid, SA）残基结合。禽流感病毒优先结合α2,3-连接的SA受体（禽源型），而人流感病毒主要结合α2,6-连接的SA受体（人源型）。这种受体结合偏好构成了流感病毒跨物种传播的主要屏障。因此，监测2023年在韩国分离的2.3.4.4b进化支H5N1病毒是否获得了人源型（α2,6-连接）SA受体亲和力，对于实时评估其人畜共患风险至关重要。本研究采用比较性、宿主特异性和区域特异性的方法，评估从鸟类到猫的物种跳跃及随后在猫群中的传播，是否伴随着可检测到的受体结合特异性的改变。
材料与方法
本研究中使用的病毒株包括：2022年10月从养殖鸭分离的H5N1流感病毒A/duck/Korea/H493/2022（Duck/YC/2022），以及2023年7月从首尔两起疫情中分离的两株猫源H5N1流感病毒，分别来自冠岳区动物收容所（A/feline/Korea/M305-7/2023， Feline/GA/2023）和龙山区（A/feline/Korea/M302-6/2023， Feline/YS/2023）。作为人源型受体高亲和力的对照，使用了2009年大流行H1N1病毒（A/California/04/2009， pdm09）。通过固相结合直接结合试验评估了病毒对生物素化的α2,3-SLN、α2,3-SL、α2,6-SLN和α2,6-SL唾液酸聚糖受体的结合亲和力。此外，研究团队还进行了结构建模、分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟以及分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（Molecular Mechanics/Poisson–Boltzmann Surface Area， MM/PBSA）分析，以从计算角度解析HA-受体的相互作用。MD模拟使用GROMACS 5.1.4软件包进行，结合自由能计算使用gmx_MMPBSA 1.5.2包完成，并使用Visual Molecular Dynamics (VMD)分析氢键相互作用。
结果
病毒株特征
在H5N1 HA蛋白中，Feline/GA/2023、Feline/YS/2023和Duck/YC/2022共享一系列共同突变。它们之间的主要差异在于第83位（H5编号）：Feline/GA/2023携带A83N突变，Feline/YS/2023包含A83D突变，而Duck/YC/2022在此位置保留了未突变的残基。
固相结合试验分析受体结合特异性
评估HA对人源受体的结合亲和力是评估流感病毒在哺乳动物宿主间高效传播潜力的关键参数。研究评估了两株2023年猫源分离株（Feline/GA/2023和Feline/YS/2023）以及一株2022年禽源分离株（Duck/YC/2022）的受体结合偏好。所有三株H5N1病毒均对禽源型α2,3-连接唾液酸聚糖（包括α2,3-SLN和α2,3-SL）表现出强结合亲和力，其结合强度在25 μg/mL聚糖浓度下约为pdm09病毒的7-29倍。相比之下，这些病毒对人源型α2,6-连接唾液酸聚糖（包括α2,6-SLN和α2,6-SL）几乎未检测到结合，其结合信号在相同条件下比pdm09低约10-61倍。这些结果提供了实验证据，表明猫源H5N1分离株保留了禽源型受体特异性。
毒株特异性结构稳定性模式
对HA与α2,3-SLN和α2,6-SLN聚糖复合物进行的MD模拟显示，所模拟系统在模拟过程中保持相对稳定。对于H1N1毒株（pdm09），α2,6-SLN复合物比α2,3-SLN复合物更稳定。相反，对于其他系统（Feline/GA/2023、Feline/YS/2023和Duck/YC/2022），α2,3-SLN复合物比其对应的α2,6-SLN复合物更稳定。作为主要关注点的受体结合位点（Receptor-Binding Site, RBS）在所有系统中均保持高度稳定，平均RMSD值始终低于2 ?，表明RBS已充分平衡，适合用于详细分析HA-聚糖相互作用。
HA1和HA2亚基的构象动力学
分析每个毒株HA蛋白的RMSD发现，H1N1毒株（pdm09）整体RMSD波动主要由HA2亚基的构象变化驱动。Feline/GA/2023毒株的HA1和HA2对观察到的结构波动贡献相当。对于Feline/YS/2023毒株，与HA2相比，HA1亚基表现出更大的构象灵活性，对HA蛋白整体RMSD变化的贡献更大。对于Duck/YC/2022毒株，HA2的构象变化解释了大部分观察到的结构波动。
结合时聚糖的构象适应
配体RMSD分析显示，在H1N1（pdm09）复合物中，α2,3-SLN比α2,6-SLN表现出更大的波动。相反，在H5N1（Feline/GA/2023、Feline/YS/2023和Duck/YC/2022）复合物中，α2,6-SLN比α2,3-SLN表现出更大的波动。通过测量配体中N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid, NeuAc）、半乳糖（Galactose, Gal）和N-乙酰半乳糖胺（N-acetylglucosamine, GalNAc）部分形成的角度（θ）进行详细分析。禽源型α2,3-SLN在所有复合物中均表现出锥形拓扑结构（θ > 110°），而人源型α2,6-SLN在所有复合物中均显示出伞形拓扑结构（θ < 110°），但与Feline/YS/2023的复合物除外。在Feline/YS/2023的情况下，较高的标准差表明存在显著的角波动，这可能解释了其略微偏离典型伞形拓扑结构的原因。观察到的θ角变化与配体的RMSD值有很好的相关性，表明聚糖构象与结构稳定性之间存在潜在关系。
病毒复合物与禽源及人源受体结合自由能比较
使用MM/PBSA方法计算了每个毒株对禽源（α2,3-SLN）和人源（α2,6-SLN）聚糖的结合亲和力。对于H1N1毒株（pdm09），人源型α2,6-SLN复合物比禽源型α2,3-SLN复合物显示出更高的结合亲和力，ΔΔG值为-2.74 kcal/mol。相反，对于H5N1毒株，禽源型α2,3-SLN复合物比人源型α2,6-SLN复合物显示出更高的结合亲和力。具体而言，Feline/GA/2023、Feline/YS/2023和Duck/YC/2022的ΔΔG值分别为3.20、5.40和1.87 kcal/mol。在H5N1毒株中，相对结合亲和力按Feline/YS/2023 > Feline/GA/2023 > Duck/YC/2022的顺序递减。
基于MM-PBSA的与受体结合差异相关残基鉴定
为了探究导致α2,3-SLN和α2,6-SLN复合物之间结合能量差异的残基，研究进行了包括单残基能量分解、最终MD帧的结合模式以及氢键（H-bond）占据率数据在内的比较分析。
在pdm09毒株中，残基Y91、T133、A134、K142和Q223（H1编号）在α2,3-SLN和α2,6-SLN复合物中均表现出高能量贡献。这些残基在模拟过程中也形成了占据率≥50%的氢键。值得注意的是，残基D222和E224在两个复合物之间观察到显著差异。D222对α2,6-SLN复合物的结合有有利贡献，但对α2,3-SLN复合物不利。相反，E224在α2,3-SLN复合物中显示出有利的能量贡献，但在α2,6-SLN复合物中不利。在α2,6-SLN复合物中，D222与配体形成了两个高占据率的氢键，这与之前的研究结果一致，即D222是α2,6-SLN结合的关键残基。相比之下，在α2,3-SLN复合物中，E224通过其侧链与配体形成了两个高占据率的氢键。
在Feline/GA/2023毒株中，残基Y91、S132和A133（H5编号）在α2,3-SLN和α2,6-SLN复合物中均显示出显著的能量贡献，每个残基都形成了占据率超过50%的氢键。残基Q222对α2,3-SLN复合物结合能的贡献比α2,6-SLN复合物更有利。在α2,3-SLN复合物中，其侧链与配体形成了三个氢键。相反，在α2,6-SLN复合物中，Q222侧链仅与配体形成了两个氢键。残基G221在α2,6-SLN复合物中的贡献更有利。其主链与配体形成的氢键占据率为82%。然而，在α2,3-SLN复合物中，该氢键的占据率较低，为22%。残基R223在α2,3-SLN复合物中表现出有利的能量贡献，但在α2,6-SLN复合物中不利。在α2,3-SLN复合物中，其侧链形成了一个占据率为28%的氢键，而在α2,6-SLN复合物中，该氢键的占据率低于10%。
在Feline/YS/2023毒株中，残基Y91、S132和A133在α2,3-SLN和α2,6-SLN复合物中对结合能均有显著贡献，氢键占据率超过69%。残基Q218在α2,3-SLN复合物中显示出有利贡献，但在α2,6-SLN复合物中贡献可忽略不计。在α2,3-SLN中，其侧链与配体形成了一个氢键（22%占据率），而在α2,6-SLN中，该氢键的占据率低于10%。残基G221在α2,6-SLN复合物中的贡献比在α2,3-SLN复合物中更有利，这与其主链和配体之间更强的氢键相互作用相关，α2,6-SLN中的氢键占据率为76%，而α2,3-SLN中为28%。Q222在α2,6-SLN复合物中的贡献也更有利。其侧链与配体形成了三个氢键，占据率更高，而在α2,3-SLN复合物中，Q222仅形成了两个氢键，占据率相对较低。R223在α2,3-SLN复合物中的贡献更有利，通过其主链和侧链建立了三个氢键。相比之下，α2,6-SLN复合物仅显示出一个占据率较低的侧链氢键。
在Duck/YC/2022毒株中，残基Y91、S132和A133在α2,3-SLN和α2,6-SLN复合物中对结合能均有显著贡献，每个残基都形成了占据率超过50%的氢键。残基Q222在α2,6-SLN复合物中的贡献比在α2,3-SLN复合物中略微更有利。在α2,6-SLN中，其侧链与配体形成了两个氢键，占据率分别为78%和48%。相比之下，在α2,3-SLN中，该残基形成了两个氢键，占据率略低，分别为60%和37%。R223在α2,3-SLN复合物中表现出更有利的能量贡献，通过其主链和侧链建立了三个高占据率的氢键。相比之下，α2,6-SLN复合物仅显示出占据率低于10%的弱相互作用。
HA–α2,3-SLN复合物的结构和能量比较
研究调查了在MM/PBSA计算中与α2,3-SLN相比α2,6-SLN结合亲和力相对较高的三株H5N1毒株（Feline/GA/2023、Feline/YS/2023和Duck/YC/2022）之间的差异。最终MD结构的叠加显示了整体的结构相似性，但RBS残基的组成和构象以及配体构象存在显著差异。
在所有毒株中，RBS始终包含残基Y91、L129、G130、V131、S132、A133、A134、W149、I151、H179、S181、N182、E186、L190、Q218、G221、Q222、R223和G224。除了这些保守残基外，还发现了毒株特异性的RBS差异。T215和M226为Feline/GA/2023所独有，H180仅存在于Feline/YS/2023中，N183为Duck/YC/2022所独有。残基P141为Feline/GA/2023和Duck/YC/2022所共有，而Y191和N220为Feline/GA/2023和Feline/YS/2023所共有。
为了评估RBS的构象灵活性，计算了每个毒株的RMSF值。总体而言，RBS灵活性按Feline/GA/2023 > Duck/YC/2022 > Feline/YS/2023的顺序递减。这种灵活性趋势与其复合物的MM/PBSA结合能（Feline/GA/2023为-35.60 kcal/mol， Duck/YC/2022为-37.98 kcal/mol， Feline/YS/2023为-40.40 kcal/mol）相关，表明灵活性降低增强了结合。
在α2,3-SLN配体中也观察到了构象变化。虽然Neu5Ac部分保持稳定，但Gal和GalNAc部分表现出不同程度的延伸，其θ角与RBS灵活性和结合能相关。
在最终MD结构中，残基V131、S132、A133、E186、Q222和R223是所有三株毒株的共同相互作用伙伴，Feline/GA/2023与H179和Y91形成了额外的氢键，Duck/YC/2022与Q218和Y91形成了额外的氢键。这些发现表明，蛋白质和配体中毒株特异性的构象变化是观察到的α2,3-SLN结合差异的主要原因。
讨论
甲型流感病毒由于具有跨物种传播能力和快速的遗传进化能力，继续对动物和人类健康构成重大威胁。其中，HPAI H5N1病毒因其日益增加的人畜共患潜力和高致死率而受到特别关注。因此，了解决定宿主特异性和传播性的分子决定因素对于评估大流行风险和指导监测策略至关重要。其中，入侵阶段的HA–SA相互作用是病毒传播性的关键决定因素。禽流感病毒优先结合α2,3-连接的SA受体。相比之下，人类流感病毒（如H1、H2和H3亚型）优先结合α2,6-连接的SA受体。这种受体结合特异性在很大程度上解释了为什么大多数HPAI H5N1病毒对禽源型α2,3-连接受体表现出强亲和力，而高效人际传播的潜力有限。
分子研究已经确定了一些关键的HA突变，包括S123P、S133A、T156A、Q222L和G224S（H5编号），这些突变可以将受体偏好转向人源型α2,6受体，从而增强跨物种传播。在先前Kim等人的研究中，他们表征了与韩国猫群致死性聚集感染相关的首批HPAI H5N1毒株。值得注意的是，韩国毒株携带了S123P、S133A和T156A突变，但缺乏关键的Q222L和G224S突变，这表明尽管它们在哺乳动物中具有致病性，但仅凭遗传证据不太可能已经获得人源型受体亲和力。然而，该研究的一个关键限制是缺乏对受体结合特性的直接实验验证。
为了克服这一限制，本研究结合实验性受体结合试验和计算分析，直接评估了受体结合谱。使用固相结合试验，研究了三株H5N1分离株（两株猫源和一株禽源）以及一株人源H1N1参考毒株，测试了它们对禽源型（α2,3-SLN）和人源型（α2,6-SLN）受体的亲和力。与之前的发现一致，H1N1（pdm09）毒株强烈结合α2,6-连接的SA受体。相比之下，所有三株H5N1毒株（Feline/GA/2023、Feline/YS/2023和Duck/YC/2022）均表现出对α2,3-连接的SA受体的强结合，而对α2,6-连接的SA受体未检测到结合。这些结果为猫源H5N1分离株保留禽源型受体特异性提供了实验证据。
本研究进行的结构建模、分子动力学模拟和MM-PBSA单残基能量分解为受体结合相互作用和能量学提供了计算上的见解；然而，这些方法本质上是预测性的，并未建立结构-功能关系。因此，识别出的结构特征和残基应被视为潜在贡献者，其功能相关性需要通过实验研究来验证。MD模拟和MM/PBSA自由能计算显示，H1N1–α2,6复合物在结构上更稳定，在能量上比H1N1–α2,3更有利，这与其人源型受体偏好一致。相反，所有H5N1毒株与α2,3-SLN形成的复合物比与α2,6-SLN形成的复合物更稳定、能量上更有利，这与它们预期的禽源型受体偏好一致。单残基能量分解和氢键占据率分析进一步揭示了导致差异结合的关键RBS残基。在所有三株H5N1毒株中，Y91、S132和A133持续对受体结合做出贡献。观察到Q218、G221、Q222和R223额外的毒株特异性效应，它们差异性地影响了受体偏好。值得注意的是，Q222成为α2,6结合的关键决定因素。尽管有报道称A133有助于α2,6结合，但本研究结果显示其在α2,3和α2,6相互作用中的贡献没有显著差异，这与先前的遗传分析一致。因此，Y91和S132是共同贡献者，而Q218、G221、Q222和R223则作为结合亲和力和宿主受体特异性的毒株特异性调节剂。
研究还评估了HA和聚糖的构象动力学。RMSD分析显示了HA1和HA2亚基中依赖于毒株的灵活性，而聚糖动力学揭示了禽源和人源受体之间的不同行为。在H1N1复合物中，α2,3-SLN比α2,6-SLN表现出更大的波动，而在H5N1复合物中，α2,6-SLN比α2,3-SLN更具动态性。与先前的研究一致，α2,3-SLN始终采用锥形拓扑结构（θ > 110°），而α2,6-SLN则显示出伞形拓扑结构（θ < 110°）。总体而言，这些拓扑结构在复合物之间保持一致，但θ值显示出依赖于毒株的变化。与α2,3-SLN的最终MD复合物的结构叠加进一步证明了RBS组成和聚糖定位的细微差异，这些差异影响了H5N1毒株间的结合能量学。RBS内部灵活性的降低与更强的结合相关，强调了局部结构刚性对于有效受体识别的重要性。总体而言，研究结果突显了蛋白质灵活性、配体拓扑结构和分子间相互作用在决定受体结合强度和特异性方面的复杂相互作用。这些发现阐明了分子界面上的细微构象差异如何驱动HA-受体相互作用和病毒宿主偏好。
总的来说，结构和能量分析表明，虽然已知H5N1病毒优先结合禽源型α2,3-连接唾液酸受体，但哺乳动物感染事件的日益增加凸显了对受体结合特性进行宿主和背景特异性重新评估的必要性。在本研究中，比较了韩国近期猫源2.3.4.4b进化支H5N1病毒与一株遗传相关的禽源毒株，以评估跨物种传播是否伴随着受体特异性的改变。观察到的禽源型受体偏好的保留表明，从鸟类到猫的跳跃发生，并未伴随向人源型α2,6受体结合的实质性转变。
这些结果与世界卫生组织和其他专家的评估一致，即适应性受体结合变化的缺失继续限制了其人畜共患潜力。然而，全球范围内H5N1哺乳动物感染数量的增加已引发了对病毒适应的合理担忧。尽管本研究强化了禽源受体偏好的证据，但其局限性包括：专注于HA–SA结合、缺乏体内传播数据以及依赖基于单体的计算分析。尽管存在这些局限性，结合计算模型的受体结合试验为了解跨物种传播潜力提供了宝贵的见解。对韩国HPAI毒株的持续监测旨在识别人类风险增加的早期指标。这些努力对于大流行防范和支持应对新发人畜共患威胁的快速公共卫生响应至关重要。
总之，尽管测试的H5N1毒株在猫中具有高毒力，但其表现出严格的禽源受体特异性，表明目前持续人际传播的风险有限。持续的基因组和功能监测对于及时检测可能预示新发大流行威胁的潜在受体结合转变至关重要。
