《Emerging Microbes & Infections》：Streptococcus suis Stk1 sensitizes epithelial cells to ferroptosis and exacerbates disruption of the respiratory epithelial barrier
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本文揭示猪链球菌2型(SS2)通过其真核样丝/苏氨酸激酶(Stk1)与宿主Keap1蛋白互作，稳定Keap1-Nrf2复合体，促使核心抗氧化转录因子Nrf2发生泛素化降解，从而瓦解细胞抗氧化防御体系，诱发呼吸道上皮细胞铁死亡(ferroptosis)。此过程导致脂质过氧化物积累、转录抑制因子Snail1上调及细胞连接蛋白表达下调，最终破坏上皮屏障完整性，促进细菌全身性播散。本研究为靶向铁死亡治疗SS2感染提供了新策略。
SS2感染在体内外破坏呼吸道上皮屏障
为确认猪链球菌2型(SS2)感染可破坏呼吸道上皮屏障，研究首先建立了小鼠鼻内攻毒模型。与对照组相比，SS2感染组小鼠的气管和肺部出现严重病理损伤，并在气管、肺部和血液中检测到更高的细菌载量。组织病理学分析证实了显著的屏障损伤，包括气管上皮纤毛断裂、剥脱以及肺泡塌陷、炎性细胞浸润。这些结构性损伤伴随着小鼠气管上皮中细胞连接蛋白E-cadherin和Occludin在蛋白和mRNA水平上的显著减少，表明细胞旁通透性增加。这些发现与在SS2感染的仔猪模型中的观察结果一致，证明了该致病机制的跨物种相关性。
为在细胞水平上进一步研究此现象，研究人员采用了极化的猪呼吸道上皮细胞(NPTr)体外模型。SS2感染导致了跨上皮电阻(TEER)呈感染复数(MOI)依赖性的下降。时序分析进一步揭示了E-cadherin和Occludin在转录和翻译水平上的进行性丢失。来自多个模型的这些发现共同证明，SS2感染通过拆解关键的细胞间连接蛋白，损害了呼吸道上皮屏障的完整性，从而促进了细菌的入侵和播散。
SS2感染诱导呼吸道上皮细胞发生铁死亡
在确认SS2破坏上皮屏障后，研究进一步探究了其细胞死亡机制，假设铁死亡在其中发挥作用。研究人员发现，SS2感染NPTr细胞可诱导典型的铁死亡形态学改变，包括完整的核膜且无出泡现象，这与经典的铁死亡诱导剂RSL3处理后的细胞形态相似。SS2感染诱导了显著的细胞毒性，并伴随着细胞内Fe2+水平的相应升高。铁死亡的一个关键驱动因素是铁依赖的脂质过氧化。相应地，经SS2刺激的细胞显示出活性氧(ROS)的显著积累，以及明显的脂质过氧化。此外，SS2感染导致典型的铁死亡生物标志物丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)水平显著增加，达到与RSL3处理相当的水平。透射电子显微镜超微结构分析揭示了线粒体空泡化和嵴的消失，这些都是铁死亡的特征性表现。这些数据综合证明，SS2感染是呼吸道上皮细胞铁死亡的有效诱导剂。
铁死亡的药理学抑制可抵御SS2诱导的上皮屏障破坏
为确认铁死亡在SS2介导的细胞毒性和屏障功能障碍中的因果作用，研究使用了特异性铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 (Fer-1)。Fer-1与SS2共处理有效地挽救了受感染的NPTr细胞免于死亡。这种保护作用与细胞内Fe2+水平的显著降低以及脂质过氧化标志物MDA和4-HNE的明显抑制相关。与此一致，Fer-1处理保留了质膜完整性，表现为碘化丙啶(PI)摄入的减少。
研究随后探讨了抑制铁死亡是否能挽救SS2诱导的上皮屏障完整性丧失。事实上，Fer-1处理显著减轻了SS2诱导的E-cadherin和Occludin在mRNA和蛋白水平的下调。在功能上，Fer-1与SS2共处理显著减弱了因感染导致的TEER下降，证明屏障功能得以保留。此外，铁死亡的药理学抑制显著限制了SS2的增殖能力。这些发现建立了SS2诱导的铁死亡与呼吸道上皮屏障破坏之间的直接联系。
脂质过氧化产物通过上调Snail1介导细胞连接破坏
在铁死亡过程中，脂质过氧化将膜脂转化为一系列活性醛类副产物，其中4-HNE和MDA是研究最为广泛的。这些化合物导致并放大了与铁死亡相关的下游生物学后果。鉴于抑制铁死亡能够挽救屏障功能，研究人员假设铁死亡标志性的脂质过氧化物积累是连接蛋白降解的原因。为验证此假设，研究人员直接用脂质过氧化的主要产物4-HNE处理NPTr细胞。仅此处理就足以导致TEER显著下降以及E-cadherin和Occludin mRNA水平的相应降低。通过Western blot和免疫荧光实验在蛋白水平上确认了这些连接蛋白的减少，表明脂质过氧化产物可以通过下调连接蛋白表达直接损害屏障完整性。
锌指转录因子Snail1是已知的上皮连接蛋白抑制因子。研究人员观察到，4-HNE处理导致NPTr细胞中Snail1的显著上调和核定位。为直接验证Snail1在此过程中的作用，研究构建了Snail1敲除(KO)的NPTr细胞系。关键的是，与野生型(WT)细胞相比，Snail1-KO细胞在SS2诱导的E-cadherin和Occludin的mRNA和蛋白水平下调方面受到显著保护。这种保护作用转化为屏障功能的显著保留，表现为受感染的Snail1-KO细胞具有更高的TEER值。这些结果共同勾勒出一个机制：SS2诱导的脂质过氧化产物（如4-HNE）上调转录抑制因子Snail1。随后，Snail1介导连接蛋白表达下调，导致上皮屏障的瓦解。
SS2通过促进Nrf2泛素化依赖的降解来触发铁死亡
为阐明SS2诱导铁死亡的分子机制，研究人员对SS2感染的NPTr细胞进行了RNA测序(RNA-seq)。KEGG通路分析显示，差异表达基因在粘附连接、紧密连接和铁死亡等相关通路上显著富集。具体在铁死亡通路内，研究人员观察到宿主关键抗氧化基因（包括Gpx4、Slc7a11、Gclc和Gclm）的显著下调。研究验证了这些发现，确认SS2感染导致Gpx4和Slc7a11的mRNA和蛋白水平随时间依赖性下降，以及细胞谷胱甘肽(GSH)水平的减少。
Nrf2是细胞抗氧化防御系统的主调控因子。有趣的是，虽然SS2感染后Nrf2的mRNA水平没有变化，但其蛋白水平显著降低，提示存在转录后调控。为明确降解途径，研究人员用蛋白酶体抑制剂(MG132)或溶酶体抑制剂(氯喹)处理受感染细胞。MG132（而非氯喹）恢复了Nrf2蛋白水平，表明泛素-蛋白酶体系统参与了其降解。随后的免疫共沉淀实验证实，SS2感染显著增加了Nrf2的泛素化。
为功能上将Nrf2降解与铁死亡表型联系起来，研究显示，用MG132阻断蛋白酶体降解不仅能稳定Nrf2，还能恢复其下游靶点Gpx4和Slc7a11的表达。抗氧化反应的恢复导致SS2感染细胞内GSH水平增加，并显著抑制了脂质过氧化。这些数据共同证明，SS2通过促进Nrf2的泛素-蛋白酶体依赖的降解，瓦解了细胞的抗氧化防御系统，从而使上皮细胞对铁死亡敏感化。
SS2效应蛋白Stk1劫持宿主Keap1-Nrf2轴以诱导Nrf2降解
为确定SS2中介导铁死亡的毒力因子，研究人员筛选了11种主要毒力因子，检测它们使NPTr细胞对RSL3诱导的脂质过氧化（铁死亡的既定标志物）敏感化的能力。真核样丝/苏氨酸激酶1(Stk1)和猪溶素(Sly)蛋白的过表达导致了最高的脂质ROS水平和细胞死亡。基于此前关于细菌丝/苏氨酸激酶参与宿主泛素化途径的报道，研究人员将Stk1作为介导Nrf2降解的主要候选因子。
构建SS2的Stk1基因缺失突变体ΔStk1及其回补菌株CΔStk1，以研究Stk1在SS2感染NPTr细胞过程中Nrf2泛素化介导降解的作用。使用SS2野生型(WT)、ΔStk1和CΔStk1菌株的实验证实，Stk1对于SS2诱导的Nrf2蛋白降解以及随后Nrf2泛素化的增加是必不可少的。由于免疫共沉淀实验显示Stk1与Nrf2之间没有直接相互作用，研究人员假设Stk1通过中间介质发挥作用。研究人员将注意力转向了Keap1，它是靶向Nrf2进行降解的Cul3-E3泛素连接酶复合物的底物接头蛋白。Keap1-Nrf2轴也参与铁死亡的调控。免疫共沉淀和免疫荧光实验证明，Stk1直接与Keap1相互作用并在细胞质中共定位。至关重要的是，Stk1的共表达增强了Keap1与Nrf2之间的相互作用，并促进了Nrf2的泛素化。这些发现共同表明，SS2感染促进了Stk1与Keap1的相互作用，从而稳定了Keap1-Nrf2复合物。这种稳定促进了Nrf2的泛素化及随后的降解。
为明确确立Keap1-Nrf2轴在此过程中的作用，研究人员利用CRISPR/Cas9系统构建了Keap1敲除(KO)的NPTr细胞系。在Keap1-KO细胞中，无论Stk1是否存在，SS2感染都减轻了诱导的Nrf2降解。因此，与Keap1-WT细胞相比，Keap1-KO细胞受到保护，免受SS2诱导的铁死亡影响，表现出显著更低的脂质ROS、MDA和4-HNE水平，以及更少的细胞死亡。这些发现表明，SS2效应蛋白Stk1劫持了宿主Keap1-Nrf2轴，通过与Keap1相互作用以稳定其与Nrf2的结合，从而促进Nrf2的泛素化和降解，触发上皮细胞铁死亡。
Stk1介导的铁死亡在体内驱动呼吸屏障破坏和细菌播散
最后，为验证Stk1-铁死亡轴的生理相关性，研究人员利用了小鼠感染模型。与体外数据一致，与感染ΔStk1突变体的小鼠相比，感染SS2野生型或回补菌株(CΔStk1)的小鼠表现出更严重的气管上皮和肺部病理损伤，并支持更高的细菌载量。在分子水平上，来自野生型和CΔStk1感染小鼠的气管组织显示出4-HNE染色升高，Nrf2蛋白水平显著降低（尽管mRNA水平未变），以及Nrf2靶点Slc7a11和Gpx4的显著下调。
至关重要的是，用铁死亡抑制剂Fer-1处理在很大程度上逆转了感染SS2野生型小鼠的这些效应，恢复了Nrf2蛋白水平和抗氧化基因表达，同时降低了脂质过氧化。这种干预也保护了屏障完整性，表现为E-cadherin和Occludin的表达得以保留。这些体内结果证实，Stk1是一个关键的毒力因子，它通过触发铁死亡来瓦解呼吸道上皮屏障，从而促进细菌入侵和全身性播散。
工作机制模型
综上所述，本研究揭示了猪链球菌破坏宿主呼吸道上皮屏障的精密毒力机制。研究人员提出了一个模型：细菌效应蛋白Stk1与宿主蛋白Keap1相互作用，从而增强核心抗氧化调控因子Nrf2的泛素化和蛋白酶体降解。由此导致的细胞抗氧化防御系统崩溃使上皮细胞对铁死亡敏感，导致4-HNE等脂质过氧化物积累。这些脂质醛类物质进而驱动转录抑制因子Snail1上调，从而抑制关键的粘附连接和紧密连接蛋白表达。这一级联反应最终导致上皮完整性丧失、细胞旁通透性增加，并最终促进细菌入侵和全身性播散。
