《Animal Biotechnology》：Transcriptomic regulation of the hypothalamic-pituitary axis by GnRH immunization in Xizang sheep
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本研究通过整合血清免疫-抗氧化指标与下丘脑-垂体转录组学，系统揭示了GnRH免疫调控高原西藏绵羊下丘脑-垂体轴的转录组特征及其分子机制。研究表明，GnRH免疫显著提升了血清IgA、IgG、IgM、SOD和GSH水平，并降低了IL-6和TNF-α，表明其可增强免疫功能和抗氧化能力。转录组分析发现，下丘脑中CYTB、ATP6、COX、ABLIM1和ABI3等基因显著上调，SHISA7和PTPRO下调，通路富集于朊病毒病、氧化磷酸化和产热等途径；垂体中RPL15上调，RPL10A、CACNA1D、ANK1、DDX3X和KCNMA1下调，通路富集于肌原纤维、收缩纤维、肌节和胞质核糖体等。关联分析显示，IgG与垂体ATP6、CYTB、TNNI2及下丘脑COX1、COX、ND4呈显著正相关。综上所述，GnRH免疫通过调节下丘脑-垂体基因表达，增强免疫和抗氧化功能，实现了神经内分泌-免疫网络的整合调控，为高原西藏绵羊的健康养殖提供了新策略。
材料与方法
本研究以30只6月龄健康雄性西藏绵羊为实验对象，随机分为对照组(CON)、手术去势组(SN)和GnRH免疫组(IM)，每组10只。SN组在实验初期接受手术去势，IM组在饲养第1天和第56天颈部皮下注射GnRH乳化抗原(含100 μg TDK)，CON组不做处理。实验为期119天。实验结束时，每组随机选取5只羊禁食12小时后，经颈静脉采血分离血清，并屠宰采集垂体与下丘脑组织样本，于液氮中速冻后保存于-80°C备用。
血清免疫指标(IgG、IgM、IgA、IL-6、TNF-α)和抗氧化指标(SOD、MDA、T-AOC、GSH)均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。采用TRIzol?Reagent提取组织总RNA，经质量检测合格后，利用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000平台进行双端150 bp测序，构建转录组文库。差异表达基因(DEGs)筛选采用DESeq2软件，以FPKM > 1、校正后p值(p-adj) < 0.05且|log2折叠变化| ≥ 1为标准。通过GO和KEGG数据库对DEGs进行功能富集分析。随机选取8个DEGs进行qRT-PCR验证。采用Spearman相关分析探究垂体与下丘脑DEGs同血清免疫、抗氧化指标间的关联。
结果
1. GnRH免疫对西藏绵羊免疫与氧化水平的影响
与CON组相比，IM组血清IgA、IgG、IgM、SOD和GSH水平均显著升高(p< 0.05)，且IgG、IgM、SOD和GSH也显著高于SN组(p< 0.05)。SN组仅IgM含量显著高于CON组(p< 0.05)。在炎症因子方面，CON组的IL-6和TNF-α水平最高，显著高于SN和IM组(p< 0.05)，而IM组的IL-6水平最低，显著低于SN组(p< 0.05)。三组间的T-AOC和MDA无显著差异(p> 0.05)。结果表明，GnRH免疫可增强免疫功能与自由基清除能力，缓解氧化应激。
2. GnRH免疫对垂体基因表达的影响
主成分分析显示，三组样本形成明显分离的簇，表明基因表达谱存在显著差异。与CON组相比，IM组有464个基因显著上调，394个基因显著下调；SN组有632个基因显著上调，353个基因显著下调。比较IM与SN组，IM组有1,825个基因显著上调，1,506个基因显著下调，表明GnRH免疫显著重塑了垂体转录组。
3. 垂体DEGs的GO与KEGG富集分析
GO富集分析显示，与CON组相比，IM组的DEGs主要富集于肌原纤维、收缩纤维、肌节和胞质核糖体等通路，其中RPL15为共同上调基因，而共同下调基因包括RPL10A、CACNA1D和ANK1。SN组的DEGs主要富集于活性离子跨膜转运蛋白活性、跨膜转运复合体以及前体代谢物和能量生成等通路，上调基因包括SLC25A22、ATP1A3和ATP5B，下调基因包括CYTB和COX1。比较IM与SN组，DEGs主要富集于肌动蛋白结合通路，且在胞质核糖体、转运复合体和核糖体亚基中也有富集，共同富集基因如DDX3X、RPL10A和KCNMA1均显著下调。KEGG富集分析表明，与其余两组相比，IM组的DEGs在核糖体、朊病毒病和氧化磷酸化通路上显著富集；而SN与CON组的DEGs则在产热和氧化磷酸化通路中显著富集。
4. GnRH免疫对下丘脑基因表达的影响
主成分分析显示，三组下丘脑基因样本各自成簇。与CON组相比，IM组有651个基因显著上调，447个基因显著下调；SN组有2427个基因显著上调，1881个基因显著下调。比较IM与SN组，IM组有2629个基因显著上调，2972个基因显著下调。
5. 下丘脑DEGs的GO与KEGG富集分析
GO富集结果显示，与CON组相比，IM组的DEGs主要富集于细胞前导边缘和神经元间突触等通路，共同上调基因包括ABLIM1和ABI3，下调基因包括SHISA7和PTPRO。而SN组的DEGs主要富集于核糖体、核糖体亚基和核糖体结构成分等通路，上调基因包括MIEF1、DDX3X、MRPL15和NSUN4，下调基因包括NDUFA7、MRPL54、MRPS16以及RPL和RPS基因家族。KEGG富集分析显示，与SN和CON组相比，IM组的DEGs在肌萎缩侧索硬化症、朊病毒病、氧化磷酸化和产热等通路中显著富集，上调基因包括CYTB、ATP6、COX基因家族和ND基因家族，下调基因为COX5A。SN组的DEGs则主要富集于代谢通路，且在核糖体、产热和内吞作用中也显著富集。
6. DEGs的qRT-PCR验证与相关性分析
随机选取的8个关键DEGs经qRT-PCR验证，结果与RNA-seq数据一致。相关性分析显示，在垂体中，免疫指标如IgA和IgG与ATP6、CYTB和TNNI2呈显著正相关，而与LAPTM4B、SLC12A5和VEGFA呈显著负相关。在下丘脑中，IgM和IgG与CYTB、ATP6、COX1、COX2和ND4呈显著正相关，而ND1和ND4也与IL-6呈显著负相关。
讨论
下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)是调控生殖功能与性激素产生的关键神经内分泌系统。本研究表明，GnRH去势可能通过双途径实现免疫调节：一方面，性腺激素的减少可缓解其对B细胞分化的抑制，促进浆细胞分泌免疫球蛋白；另一方面，对HPG轴的抑制可能通过神经内分泌网络间接调节氧化应激通路，表现为SOD和GSH活性显著升高。
转录组分析发现，GnRH免疫后，下丘脑中与线粒体功能相关的基因如ATP6和CYTB上调，且与IgG和IgM水平呈正相关，表明GnRH免疫通过增强氧化磷酸化维持免疫稳态。而COX5A、SHISA7和PTPRO的下调则破坏了线粒体复合物，导致活性氧(ROS)失衡和下丘脑炎症微环境形成，从而引发GnRH网络功能障碍，揭示了GnRH去势中代谢-免疫-神经网络的交互对话机制。下丘脑差异基因在细胞前导边缘、神经元间突触、朊病毒病、肌萎缩侧索硬化症、氧化磷酸化和产热等通路中的显著富集，进一步证明GnRH免疫诱导了能量代谢损伤和钙离子失衡，最终导致生殖功能下降。
在垂体研究中，DDX3X和KCNMA1基因的下调降低了mRNA翻译并损害了钙激活钾通道功能，导致促性腺激素细胞膜兴奋性降低。ANK1的下调进一步破坏了神经内分泌神经元的细胞骨架完整性和膜结构域稳态。本研究中，RPL10A、CACNA1D、ANK1、DDX3X和KCNMA1等基因显著下调，表明GnRH免疫通过调控核糖体相关基因的表达，破坏了垂体细胞的翻译-分泌偶联机制。下丘脑和垂体中差异表达基因在“细胞前导边缘与神经元间突触”、“朊病毒病与肌萎缩侧索硬化症”、“氧化磷酸化”和“产热”等通路中的显著富集，进一步表明GnRH主动免疫通过协调调控垂体能量代谢、蛋白转运和免疫微环境，整合了神经内分泌和应激-免疫反应，从而影响生殖行为和生理过程。
手术去势可直接消除性腺负反馈，引发下丘脑-垂体轴的代偿性激活。本研究中，手术组的线粒体相关基因MIEF1、DDX3X、RPL和RPS主要富集于核糖体、核糖体亚基和核糖体结构成分，提示手术去势破坏了垂体-下丘脑轴的线粒体和核糖体功能网络，导致整体细胞翻译水平降低，从而影响下丘脑代谢重塑和应激适应。垂体中SLC25A22、ATP1A3和ATP5B的上调，以及CYTB和COX1的下调，共同揭示了线粒体能量代谢在手术去势后适应性反应中的关键作用。DDX3X和NSUN4的上调可抑制肿瘤细胞增殖并增强基因组稳定性，它们在手术去势组中的共同上调提示手术去势可能通过独特的基因调控模式发挥更持久的抗肿瘤作用。
结论
本研究系统评价了GnRH免疫对西藏绵羊下丘脑-垂体-性腺轴、免疫功能和抗氧化能力的影响。结果表明，主动GnRH免疫增强了体液免疫，改善了抗炎微环境，并提升了抗氧化能力。在分子水平上，下丘脑中线粒体编码基因包括ATP6、CYTB、COX和ND基因家族上调，并与IgG和IgM呈正相关，驱动能量代谢的代偿性激活以维持免疫稳态。差异表达基因富集于细胞前导边缘、朊病毒病和肌萎缩侧索硬化症等通路，破坏了神经内分泌平衡，抑制了HPG轴功能和促性腺激素合成。在垂体中，RPL15上调，而RPL10A、CACNA1D、ANK1、DDX3X和KCNMA1下调，并显著富集于核糖体、朊病毒病和氧化磷酸化通路，从而破坏垂体细胞的翻译-分泌偶联，导致促性腺激素细胞膜兴奋性降低和囊泡运输障碍。LAPTM4B、SLC12A5和VEGFA与IgA和IgG呈负相关，表明GnRH免疫在抑制HPG轴功能的同时保留了免疫优势。总而言之，GnRH免疫实现了神经内分泌与免疫应答的整合调控，为西藏绵羊的高效、低应激去势技术提供了理论支持，有助于健康养殖实践的发展。
