《Animal Cells and Systems》：Notch signaling in leech neurogenesis: expression patterns and functional insights in the Glossiphoniid leech Helobdella austinensis
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本研究聚焦于软体动物门环节动物的神经发育机制，通过系统解析水蛭Helobdella austinensis中Notch信号通路核心基因的表达图谱及功能，揭示了其在体节形成与神经分化中的关键作用。文章在H. austinensis全基因组数据中鉴定出Notch通路成分，通过荧光原位杂交绘制了从胚胎第8至11期的时空表达模式，并利用γ-分泌酶抑制剂DAPT进行功能干扰，证明Notch信号缺失会破坏神经索形成并下调转录因子表达。此项工作为理解双侧对称动物神经发育的进化保守机制提供了重要证据。
引言
细胞间通讯是多细胞生物发育与维持的基础，Notch信号通路是其中最进化保守的通路之一，在相邻细胞的近分泌信号传导中扮演着核心角色。该通路在果蝇、线虫及脊椎动物等模式生物中的功能已被广泛研究，但在冠轮动物中的认知仍十分有限。水蛭作为环节动物的代表，缺乏体表刚毛，并具有前后吸盘的特征性器官，其胚胎发育过程，特别是体节化和神经发生机制，是研究进化发育生物学的良好模型。随着Helobdella austinensis全基因组的测序完成，为深入研究该物种的Notch信号通路提供了可能。
材料与方法
研究使用在忠北大学再生与进化发育实验室饲养的H. austinensis胚胎。从全基因组数据中鉴定出Notch通路的核心成分，包括受体基因Hau-notch1与Hau-notch2、配体基因Hau-delta与Hau-jagged，以及转录因子基因Hau-hes与Hau-hey。通过系统发育分析和结构域组成分析验证了这些基因的同源性及功能结构域的保守性。利用原位杂交技术描绘了这些基因在胚胎第8至11期的时空表达图谱。为探究Notch信号的功能，在胚胎第7期使用γ-分泌酶抑制剂DAPT进行处理，并通过免疫荧光染色评估其对腹神经索发育的影响，同时利用定量PCR检测下游转录因子表达水平的变化。
结果
Notch信号通路基因的鉴定与系统发育分析
研究在H. austinensis中鉴定出两个Notch受体、一个Delta、一个Jagged、一个Hey及三个Hes基因。本研究重点分析了Hau-notch1、Hau-delta、Hau-jagged、Hau-hes和Hau-hey。结构域分析显示，Hau-Notch1和Hau-Notch2含有典型的EGF重复序列、LNR结构域及ANK重复序列等。配体蛋白含有MNLL和DSL结构域，转录因子则包含bHLH和Orange结构域。系统发育分析证实了这些成分在后生动物中的保守性。
胚胎外包期Notch成分在前部细胞簇的特异性表达
在胚胎第8期早期，Hau-notch1、Hau-delta和Hau-jagged在体节前体细胞中表达，并在前部细胞簇中表达更强。到第8期中期，这些基因的表达沿生发板持续。下游转录因子Hau-hes和Hau-hey则表现出不同的表达模式：Hau-hes在融合的生发板中少量细胞表达，而Hau-hey在左右生发带前部的成对细胞中表达。双荧光原位杂交结果显示，Notch配体与受体在生发板前部细胞簇中共表达，甚至在相邻细胞中存在重叠信号，提示细胞间相互作用的可能性。
器官发生期Notch成分在体节-神经节及多部位的表达
在第9至11期的器官发生阶段，Notch成分的表达呈现出更复杂和特异的模式。第9期，Hau-notch1在原口和内脏前体中表达，同时在腹生发板表达。在吻部外翻和回缩阶段，其在前吸盘前体、内脏肌肉、腹神经节及后吸盘前体中均有强烈表达。第11期，Hau-notch1转录本在口器、前后吸盘、肠道边界以及每个体节神经节的神经纤维网胶质细胞和根神经细胞中被检测到。
配体Hau-jagged的表达模式与Hau-notch1相似，在第9期于原口和生发板推测的外胚层谱系中表达，随后在吻腔、内脏肌肉及吸盘前体中强烈表达。第11期，Hau-jagged在全身体节呈现“盐和胡椒”式的点状表达，并在神经节的侧包和推测的Retzius细胞中表达。另一配体Hau-delta的表达模式与Hau-jagged类似，也在食道、肠道边界、吸盘及神经细胞中表达。
转录因子Hau-hes在第9期仅在内脏肌肉中表达，但在第10至11期，在发育中的吻部、吸盘、内脏肌肉及体侧出现点状表达，这些点状表达可能与感觉细胞相关。而Hau-hey的表达则随时间推移从生发板向后部减弱，最终在第11期限定于后吸盘表达。
抑制Notch信号导致神经节发生过程中的神经退化
为探究Notch信号在神经系统发育中的功能，研究使用DAPT抑制该通路。在阴性对照中，每个体节神经节中的前支、中支和后支神经分支清晰可见。10 μM DAPT处理开始导致每个体节神经节中轴突生长缺陷和连接神经元缺失，以及发育中吻部的神经纤维分布异常。25 μM浓度处理则导致腹神经索形成和轴突生长严重紊乱。
免疫荧光染色进一步证实，DAPT处理导致推测的神经纤维网和连合中微管蛋白乙酰化（ac-tubulin）的表达退化，荧光强度显著降低。定量分析显示，荧光强度从对照组的7.5 ± 0.4降至DAPT处理组的2.66 ± 0.39。同时，定量PCR结果显示，DAPT处理后，Hau-hes和Hau-hey的mRNA表达水平下降了超过60%，表明Notch信号被有效抑制。
讨论
本研究在Glossiphoniid水蛭H. austinensis中鉴定并表征了Notch信号通路的核心成分。系统发育分析支持了这些成分在冠轮动物乃至后生动物中的保守性。表达谱分析揭示了Notch成分从胚胎第8期（生发板形成期）到第11期（器官发生期）的动态变化。在第8期，它们沿生发板及前部体节前体细胞的表达提示Notch信号可能参与体节发生和前后轴的形成。在第9至11期，这些成分在吸盘、吻部、背中线和腹神经节等神经相关结构中的表达，强有力地支持了Notch信号在水蛭神经发育中的重要作用。
功能实验进一步证实了这一观点。通过DAPT抑制Notch信号，导致腹神经索形成缺陷、轴突生长受损以及下游靶基因Hau-hes和Hau-hey表达下调，这与在涡虫等其他动物模型中的观察结果一致。这表明Notch信号的精确调控对于水蛭胚胎发生过程中正常的神经发生和体节形成至关重要。
总之，本研究通过整合基因组学、表达谱分析和功能实验，揭示了Notch信号通路在H. austinensis体节发生和神经发育中的关键作用。这些发现不仅加深了对冠轮动物发育机制的理解，也为探索双侧对称动物神经发生和体节化的进化保守机制提供了重要见解。
