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这篇研究深入探讨了在湍流与静态条件下，食品工业相关细菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)形成的多物种生物被膜的动力学。研究重点关注了顺序定植（即一种细菌在另一种已形成的成熟生物被膜上定植）对生物被膜形成过程（附着、成熟、脱落）及空间结构的影响。核心发现表明，在湍流条件下，单增李斯特菌在预形成的荧光假单胞菌生物被膜上的附着显著增强，并能更快达到更高的细胞浓度，展现出主导地位。相比之下，从荧光假单胞菌提取的胞外多糖(EPS)单独作为表面条件层并不影响李斯特菌的附着，提示生物被膜的结构而非单纯的EPS浓度是关键因素。这项研究强调了在模拟真实食品加工环境（如存在流体剪切力）时，定植顺序是影响多物种生物被膜群落生活方式和病原菌持久性的一个关键变量，对食品安全控制具有重要启示。
在自然和工业环境中，细菌很少单独存在，它们更倾向于形成结构复杂的多物种生物被膜。这种群落生活方式不仅增强了细菌对环境压力的抵抗力，也使得像单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)这样的食源性病原体能够在食品加工设施中持续存在，构成严重的公共卫生风险。传统的多物种生物被膜研究常假设所有细菌同时接触并定植于表面，然而在实际场景中，细菌的到达和定植往往是顺序发生的。本研究以此为切入点，系统分析了在湍流和静态两种流体条件下，工业相关细菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与单增李斯特菌之间顺序定植对多物种生物被膜形成的影响。
材料与方法
研究使用了来自乳制品和土壤环境的荧光假单胞菌(P1)和单增李斯特菌(H1)菌株。生物被膜在不锈钢试片（一种工业相关表面）上形成。实验设计了三种定植条件：1) 荧光假单胞菌预形成生物被膜48小时后，再引入单增李斯特菌（顺序定植）；2) 单增李斯特菌预形成生物被膜48小时后，再引入荧光假单胞菌（顺序定植）；3) 两种细菌同时接种（共接种）。这些条件分别在静态（孔板）和连续湍流系统（CDC生物反应器，250 rpm，模拟管道内流动）中进行评估。生物被膜的形成过程被细分为附着（30分钟）、成熟（长达7天）和脱落阶段，并通过玻璃珠打散法和选择性培养基平板计数来量化活菌数（log CFU cm-2）。此外，研究还探讨了假单胞菌生物被膜“年龄”（24, 48, 72小时）对李斯特菌附着的影响，并评估了用从假单胞菌提取的冻干再水化胞外多糖(EPS)（0–27.5 μg ml-1）预先涂布不锈钢表面对李斯特菌附着的作用。最后，利用共聚焦显微镜（DAPI和WGA-Texas red染色）观察了第五天时多物种生物被膜的空间排列结构。
顺序生物被膜在湍流下的形成
在湍流条件下，定植顺序的影响尤为显著。附着阶段，单增李斯特菌在48小时预形成的假单胞菌生物被膜上的初始附着量（5.0 ± 0.4 log CFU cm-2）显著高于其在无菌不锈钢表面（4.0 ± 0.2 log CFU cm-2）或与假单胞菌共接种时（2.57 ± 0.3 log CFU cm-2）的附着量。相反，荧光假单胞菌在预形成的李斯特菌生物被膜上的附着量（2.32 ± 0.13 log CFU cm-2）则与共接种时（2.47 ± 0.24 log CFU cm-2）相当，且低于其在无菌表面的单物种附着。这表明预形成的假单胞菌生物被膜为李斯特菌提供了更有利的附着位点，而预形成的李斯特菌生物被膜则可能抑制了假单胞菌的附着。
在成熟阶段，当单增李斯特菌接种到预形成的假单胞菌生物被膜上时，其在共同生长的第一天就迅速达到峰值浓度（8.9 ± 0.2 log CFU cm-2），比其在共接种条件（第三天达到8.8 ± 0.4 log CFU cm-2）或作为先定植菌时（第三天达到9.0 log CFU cm-2）都要快。这意味着假单胞菌预形成的生物被膜基质为李斯特菌的快速增殖提供了“跳板”。而荧光假单胞菌的细胞浓度在不同定植顺序下未显示出显著差异，均在共同生长的第2-3天达到平台期（约7.5-8.0 log CFU cm-2）。
关于脱落，在共同生长3天后，所有湍流下的双物种生物被膜都观察到了细胞周期性的脱落（“脱落波”）。在假单胞菌预形成的生物被膜中，两种细菌的浓度同步下降；而在李斯特菌预形成的生物被膜中，只有假单胞菌的浓度出现波动，李斯特菌的浓度则保持稳定高位（8.6–9 log CFU cm-2），提示李斯特菌在湍流下形成了更稳固的附着。
顺序生物被膜在静态下的形成
在静态条件下，定植顺序的影响与湍流下不同。附着时，单增李斯特菌在预形成假单胞菌生物被膜上的附着量与在共接种或单物种条件下无显著差异。然而，荧光假单胞菌在预形成李斯特菌生物被膜上的附着量（3.3 ± 0.3 log CFU cm-2）则显著低于其在共接种（4.2 ± 0.1 log CFU cm-2）或单物种条件下的附着。
在成熟阶段，静态条件下荧光假单胞菌在所有三种定植序列中均占据主导地位，其细胞浓度峰值（约6.8-7.5 log CFU cm-2）不受李斯特菌引入时机的影响。而李斯特菌的浓度峰值较低（约5.6-6.3 log CFU cm-2），且在不同条件下差异有限。
在脱落阶段，一个有趣的现象是，当荧光假单胞菌作为后定植菌接种到预形成的李斯特菌生物被膜上时，出现了对李斯特菌的“窒息”效应：李斯特菌的细胞浓度从共同生长第一天的6.3 ± 0.4 log CFU cm-2大幅下降到第五天的2.3 ± 0.3 log CFU cm-2。这可能是由于后到的假单胞菌占据了生物被膜表层，限制了底层李斯特菌对营养和氧气的获取。
在假单胞菌生物被膜和EPS条件表面的附着
为探究假单胞菌生物被膜促进李斯特菌附着的机制，研究检测了李斯特菌在不同“年龄”（24, 48, 72小时）的假单胞菌生物被膜上的附着。在湍流下形成的假单胞菌生物被膜上，李斯特菌的附着量随生物被膜年龄增加而线性增加（R2=0.98），从24小时时的3.9 ± 0.1 log CFU cm-2增加到72小时时的4.9 ± 0.1 log CFU cm-2。然而，在静态下形成的假单胞菌生物被膜上，未观察到这种趋势。
接下来，研究测试了假单胞菌产生的EPS本身是否是关键因素。用不同浓度（0–27.5 μg ml-1）的提取EPS预先涂布不锈钢表面，形成条件层。结果表明，无论是在静态还是湍流条件下，EPS浓度对单增李斯特菌的30分钟附着均无显著影响。这强烈暗示，生物被膜的整体结构、其中活菌的存在或其他基质成分，比单纯沉积的EPS浓度，在促进后续细菌附着中扮演了更重要的角色。
共接种和预形成生物被膜的空间排列
共聚焦显微镜图像揭示了流体条件如何影响生物被膜的最终结构。在湍流下形成的所有三种序列的双物种生物被膜中，单增李斯特菌（红色）在视觉和细胞计数上都占据了主导地位，显示出细菌可以在湍流下重新排列自身位置，最终形成以李斯特菌为主的群落结构。相比之下，在静态条件下，接种顺序显著影响了空间排列：当李斯特菌后定植于假单胞菌生物被膜时，可见其更多位于表层（红色区域强度较高）；而当假单胞菌后定植于李斯特菌生物被膜时，红色（李斯特菌）信号减弱，这与细胞计数中观察到的“窒息”效应相符。
讨论与结论
本研究系统阐明，在模拟食品加工管道湍流的环境中，定植顺序是决定多物种生物被膜命运的关键变量。像单增李斯特菌这样的病原体，能够有效整合、甚至偏爱在像荧光假单胞菌这样的腐生菌预形成的生物被膜中定植。预形成的假单胞菌生物被膜不仅显著增强了李斯特菌的初始附着，还使其生物被膜成熟速度大大加快，并在群落中取得数量优势。这种促进作用并非由游离的EPS分子单独介导，而是依赖于活菌存在下的完整生物被膜结构（可能包括其三维架构、表面粗糙度、其他基质成分及代谢活动）。
研究还揭示了流体条件的核心重要性：湍流促进了李斯特菌的附着、快速生长及其在群落中的主导地位，而静态条件则更有利于假单胞菌的竞争优势展现。此外，脱落模式也受定植序列影响，在湍流下，李斯特菌表现出更强的留存稳定性。
这项研究的发现对食品安全领域具有直接意义。它强调了在评估和制定针对食品加工环境中持久性病原菌（如单增李斯特菌）的清洗消毒策略时，必须考虑流体力学条件以及不同微生物（特别是产生大量基质的腐生菌）之间通过顺序定植建立的协同关系。未来研究需要进一步解析在流体剪切力下形成的特定生物被膜结构，及其如何为后续病原菌提供物理锚定和营养庇护所，从而为开发更有效的生物被膜干预措施提供理论基础。
