启动三级淋巴结构用于癌症免疫治疗
摘要
三级淋巴结构是慢性炎症或肿瘤微环境中由淋巴细胞和抗原呈递细胞形成的异位淋巴聚集体，其启动阶段是激发有效抗肿瘤免疫反应的关键步骤。本综述系统总结了驱动TLS启动的关键触发因素和信号网络，阐述了TLS如何重塑TMEs、促进抗原呈递和招募免疫细胞以增强抗肿瘤免疫反应。此外，还讨论了调控TLS启动的潜在策略，以及TLS作为癌症免疫治疗中有前景靶点的新兴作用。
引言
随着免疫检查点阻断疗法在癌症治疗中的革命性突破，免疫治疗已成为现代肿瘤学的焦点。研究表明，患者预后与肿瘤微环境的动态特征密切相关。然而，许多实体瘤仍表现出免疫学上的“冷”表型，限制了ICB的疗效。因此，调控TMEs以将“冷”肿瘤转变为具有丰富免疫细胞浸润的“热”肿瘤，已成为提高免疫治疗应答率和改善患者预后的关键目标。
作为关键的免疫枢纽，TLS通过抗原呈递和淋巴细胞激活为抗肿瘤反应提供关键支持。TLS在结构上类似于次级淋巴器官，由T细胞、B细胞、树突状细胞和高内皮静脉组成。TLS的形成始于启动阶段，该阶段由淋巴组织诱导细胞和淋巴组织组织细胞通过细胞因子和趋化因子网络的相互作用驱动。这一阶段为淋巴细胞浸润和细胞因子信号传导建立了框架，直接影响抗肿瘤免疫的强度和效果。研究表明，高效的TLS启动与增强的ICB反应性和良好的患者预后相关，突显了其在塑造TMEs和癌症免疫治疗中的关键作用。
TLSs的启动
TLSs是病理性条件下在非淋巴器官中出现的异位淋巴结构。与SLOs不同，TLS不是在胚胎发生期间出现，而是在出生后响应慢性炎症刺激而形成，可以出现在肿瘤、自身免疫性疾病和其他慢性炎症环境等多种环境中。
TLS的启动始于由慢性炎症或持续抗原刺激触发的免疫微环境改变。炎症因子的积累会动员LTi细胞，LTi细胞表达淋巴毒素α1β2和肿瘤坏死因子。这些因子与LTo细胞上的淋巴毒素β受体和TNFR结合，激活经典和非经典NF-κB通路。该信号传导过程促进基质细胞分泌血管内皮生长因子A/C，从而促进HEV的发育，并诱导各种粘附分子的表达。此外，LTα1β2–LTβR信号传导触发一系列趋化因子的产生。这些趋化因子不仅诱导淋巴细胞表达LTα1β2，还从邻近的HEV招募淋巴细胞，并调节它们进入T细胞和B细胞区域。
TLS的启动阶段在机制和功能上不同于后续的成熟阶段。TLS启动在操作上以淋巴趋化因子的诱导、新生PNAd+HEV样血管的出现、LTβR-NF-κB信号的早期激活以及免疫细胞招募的开始为特征。相比之下，TLS成熟则以清晰的T细胞和B细胞区、滤泡树突状细胞网络的形成、生发中心反应以及记忆T细胞和B细胞的产生来定义。在功能上，启动为淋巴细胞的进入和启动建立了允许的免疫微环境，而成熟则赋予了完全的细胞和体液免疫能力。除了其结构特征，TLS的启动阶段是决定抗肿瘤免疫效果的关键决定因素。横跨多种实体瘤的临床和转录组学研究表明，表现出早期TLS特征或趋化因子生态位特征的肿瘤显示出增强的免疫浸润和对ICB改善的反应性。
启动信号
TLS的启动是免疫系统在慢性炎症微环境或TMEs中发展的一种适应性反应，其启动机制涉及多层调节网络。因此，理解TLS启动的原因对于免疫治疗至关重要。本节系统地总结了启动TLS的因素及其潜在机制。
细胞因子
细胞因子是由免疫或非免疫细胞分泌的小分子蛋白质，可以参与免疫反应。TLS的启动过程涉及多种细胞因子和趋化因子的协同作用，它们为免疫细胞聚集建立了初始微环境。由LTi细胞分泌的LTα1β2和TNF分别与LTo细胞上的LTβR和TNFR结合。它们共同促进LTo细胞分泌趋化因子和粘附分子。同时，由LTi细胞分泌的白细胞介素-17与LTo细胞上的IL-17R结合，与LTα1β2–LTβR信号轴协同作用，驱动LTo细胞释放趋化因子，从而引导免疫细胞聚集到炎症部位。值得注意的是，由LTo细胞分泌的IL-7和核因子κB受体激活因子配体可以反过来与LTi细胞上的IL-7R和RANK结合，增强LTα1β2–LTβR信号轴，形成正反馈回路。该信号轴还促进LTo细胞分泌VEGFA/C，从而促进HEV的生成。
除了经典通路，许多其他机制也可以启动TLS。例如，在干燥综合征中，免疫成纤维细胞通过ICOS–LTα–CCL19信号轴调节TLS启动。肿瘤坏死因子超家族成员14是另一种LTβR配体，也称为LIGHT。研究表明，LIGHT–LTβR通路促进LTo细胞产生CCL21并激活HEV形成，参与TLS的启动阶段。此外，I型干扰素和IL-1已被证明可以刺激LTo细胞分泌CXCL13并招募B细胞来启动TLS。最近的一项研究进一步表明，IL-33可以诱导ILCs产生淋巴毒素，从而通过激活淋巴基质程序触发TLS启动。主要由T细胞、ILCs和自然杀伤细胞分泌的IL-13和IL-22上调LTo细胞中粘附分子的表达，是启动阶段的关键因素。
微生物因素
微生物的活动与TLS的启动密切相关。微生物引起的慢性炎症反应可以重塑局部免疫微环境，为TLS启动创造有利条件。
细菌
炎症在TLS的启动中起着关键作用，而细菌可以调节炎症的发生和进展，这可能反过来影响TLS的启动。细菌释放的病原体相关分子模式被宿主免疫细胞上的模式识别受体识别。这种PAMP–PRR相互作用快速激活免疫细胞和基质细胞，导致大量促炎细胞因子和趋化因子的释放。例如，来自具核梭杆菌的脂多糖可以被免疫细胞上的TLR4识别，激活TLR4/MyD88级联反应并刺激NF-κB通路，从而诱导炎症。研究证明，口服活鼠李糖乳杆菌通过增加肿瘤中DCs和T细胞的浸润来增强免疫治疗效果。LGG还激活了环GMP–AMP合酶–干扰素基因刺激因子通路，这可能进一步促进TLS启动。越来越多的证据也表明，肠道微生物群可以通过调节宿主免疫功能和TLS相关趋化因子来促进TLS形成。总之，这些发现表明细菌在TLS的启动中起着关键作用。
病毒
作为外源性病原体，病毒可以通过激活宿主先天免疫反应来启动TLS。病毒核酸和蛋白质可以被DCs、巨噬细胞和成纤维细胞通过TLRs等受体识别，从而诱导IFN-I和各种促炎细胞因子。溶瘤病毒作为一类新型免疫治疗剂，不仅可以释放肿瘤相关抗原，还可以招募T细胞，使其能够特异性靶向并消除癌细胞。此外，OVs可以通过STING通路激活DCs，从而促进TLS形成。溶瘤单纯疱疹病毒已被证明可以通过上调CXCL10/CXCR3信号传导介导TLS启动。进一步的研究证明，JAK蛋白激酶抑制剂鲁索替尼和oHSV的组合增强了免疫细胞向TME的浸润，这些变化提示TLS诱导。然而，也存在矛盾的报道，显示病毒感染与TLS形成之间没有关联，表明这种结果可能取决于病毒类型以及特定的组织微环境。
真菌
尽管目前没有直接证据证明真菌调节TLS启动，但从真菌感染的分子机制中可以推断出潜在的关联。研究表明，白色念珠菌可以通过其细胞壁中的β-葡聚糖激活上皮细胞中的IFN-I通路，而IFN-I又反过来诱导LTo细胞产生与启动相关的趋化因子。与细菌相比，真菌细胞壁成分如β-葡聚糖和甘露聚糖可以通过包括Dectin-1和TLR2/TLR4在内的受体激活巨噬细胞和DCs，导致促炎细胞因子的分泌，从而启动免疫反应。在真菌刺激下，成纤维细胞可以分化为CCL21+亚群，这些亚群通过分泌CXCL12等因子招募免疫细胞。
这些发现表明，微生物通过多种分子机制参与TLS的启动和功能调节。值得注意的是，微生物在TLS诱导中表现出双重作用：一方面作为抗肿瘤免疫的枢纽，另一方面在自身免疫性疾病中作为致病介质。
代谢因素
代谢作为细胞功能的核心调节网络，通过葡萄糖代谢、脂质代谢和氨基酸代谢等多种途径对TLS的启动产生深远影响。
葡萄糖代谢
葡萄糖代谢与免疫细胞功能密切相关，既是能量的核心来源，也是信号通路的调节者，并可能通过多种机制促进TLS启动。一方面，糖酵解增强效应T细胞的活化和促炎细胞因子的分泌。这些效应维持慢性炎症信号，这是TLS启动的先决条件。另一方面，葡萄糖代谢也影响T滤泡辅助细胞的功能，而Tfh细胞对于B细胞激活和GC形成至关重要。ATP柠檬酸裂解酶催化线粒体来源的柠檬酸转化为乙酰辅酶A和草酰乙酸。最近的一项研究表明，抑制ACLY会导致趋化因子CXCL13的上调，从而促进B细胞浸润并促进TLS的启动。因此，增强免疫细胞的糖酵解活性可以间接影响TLS的启动和形成。
除了直接作用于免疫细胞，葡萄糖代谢还可以通过其他机制影响TLS启动。首先，糖酵解增强导致乳酸积累，这不仅改变了局部pH值，还作用于内皮细胞和成纤维细胞，促进血管生成和基质重塑。其次，葡萄糖代谢可以激活代谢信号通路，从而促进趋化因子和炎症细胞因子的表达，从而加强淋巴细胞的招募和定位。
脂质代谢
脂质代谢是维持细胞稳态的基本生物过程，包括脂质摄取、合成和氧化。最近的研究表明，脂质代谢在调节免疫细胞功能方面起着关键作用，并可能通过这些效应与TLS的启动相关联。巨噬细胞根据其脂质代谢状态表现出不同的极化状态：脂肪酸氧化通常促进向M2表型分化，而饱和脂肪酸和胆固醇的代谢失调可以驱动M1极化，从而增强炎症和抗肿瘤活性。DCs的抗原呈递能力同样受到脂质代谢的影响，因为过度的脂滴积累会损害其功能并削弱T细胞刺激。对于T细胞，激活和记忆阶段通常都依赖FAO来维持能量供应。
TLS启动依赖于持续的炎症信号、趋化因子网络以及T细胞和B细胞的协调招募。脂质代谢通过塑造免疫细胞的功能状态间接促进了这一过程。促炎脂质介质，如氧化的LDL和花生四烯酸衍生物，可以增强DCs和巨噬细胞的活性，诱导趋化因子分泌，从而促进淋巴细胞招募。
氨基酸代谢
越来越多的证据表明，氨基酸代谢在TLS的启动中起着关键作用。谷氨酰胺作为免疫细胞最重要的氮和碳源之一，在T细胞和B细胞激活后，其摄取和利用显著上调。谷氨酰胺不仅为TCA循环提供燃料，还激活mTORC1信号通路，促进淋巴细胞增殖和Tfh细胞分化。通过这些效应，谷氨酰胺有助于TLS的启动和成熟。色氨酸代谢通过免疫抑制途径间接影响TLS的功能和组成。吲哚胺-2,3-双加氧酶介导的犬尿氨酸通路显著消耗局部色氨酸水平，限制过度的T细胞激活，而犬尿氨酸代谢物诱导调节性T细胞的分化。该通路通过平衡效应T细胞与Tregs的比例来防止TLS形成早期阶段过度的炎症损伤，从而决定TLS的免疫学特征和持久性。精氨酸代谢在TLS结构重塑和血管生成中也起着关键作用。通过一氧化氮合酶途径，精氨酸被转化为一氧化氮，一氧化氮不仅调节炎症反应，还促进血管生成和内皮细胞活化，为TLS启动提供必要条件。
能量代谢和氧化还原
线粒体代谢的主要功能是能量转换，其TCA和氧化磷酸化过程不仅为细胞提供ATP，还通过代谢中间体参与信号传导。氧化应激作为代谢异常的产物，对TLS启动具有双向调节作用。NADPH氧化酶产生的活性氧可以通过激活NF-κB信号传导和诱导ICAM1和CXCL12的表达来启动TLS形成。然而，过度的ROS积累可能会抑制LTo细胞中的FAO，从而减少能量供应并影响TLS的维持。乙酰辅酶A乙酰转移酶1是一种线粒体定位的酶，主要通过乙酰化调节蛋白质功能，在线粒体代谢中起关键作用。在非小细胞肺癌中，ACAT1作为TLSs的代谢调节剂，在启动阶段起着关键作用。机制研究表明，ACAT1导致肺肿瘤细胞中线粒体蛋白过度琥珀酰化，从而增强线粒体氧化代谢，最终抑制TLS形成。
在维持氧化还原平衡方面，谷胱甘肽代谢起着核心调节作用。谷胱甘肽是最丰富的细胞内抗氧化剂之一，通过调节氧化还原状态来维持免疫细胞稳态。最近的研究表明，在肾脏的TLSs中谷胱甘肽显著积累。谷胱甘肽代谢不仅可以防止过度的氧化应激对免疫细胞造成损伤，还可以通过调节信号通路间接促进免疫细胞活化，从而为TLS启动创造有利条件。
细胞死亡
近年来，细胞死亡也被认为是启动TLS形成的关键因素之一。细胞死亡对于正常组织的更新和全身稳态的维持至关重要。不同形式的细胞死亡不仅具有细胞清除和组织修复的功能，还通过抗原释放、损伤相关分子模式的暴露以及炎症介质分泌等机制塑造局部免疫微环境，从而影响TLS启动。研究表明，在肿瘤和慢性感染等情况下，大量细胞死亡产生的抗原和炎症信号可以作为TLS启动的关键驱动力。例如，免疫原性细胞死亡已被证明可以促进TMEs内的TLS形成并增强局部抗肿瘤免疫。
坏死
坏死是一种典型的非程序性细胞死亡形式，其特征是质膜破裂，导致细胞内内容物直接释放到细胞外环境中，从而引发强烈的炎症反应。坏死细胞释放大量抗原和DAMPs。这些分子可以被DCs和巨噬细胞等免疫细胞识别和摄取，从而激活下游炎症信号通路。同时，这些DAMPs可以诱导与TLS启动相关的各种炎症和趋化因子相关因子的表达，促进淋巴细胞向炎症部位的招募。例如，HMGB1可以与DCs上的TLR4结合，促进DC成熟和促炎细胞因子的释放。坏死触发的分子机制对于TLS启动具有重要意义。值得注意的是，坏死相关的炎症发挥双重作用：适当水平的抗原和炎症信号可以促进TLS的启动和形成，有利于局部免疫反应，而过度或不受控制的坏死可能导致组织损伤，从而改变TLS的功能特性。
凋亡
细胞凋亡过程伴随着DNA降解、染色质凝聚、细胞膜出泡和凋亡小泡形成。这些变化确保了细胞内容物的有序释放和随后的吞噬清除，从而维持微环境稳态。细胞凋亡可能通过释放吸引免疫细胞招募的信号分子，促进抗原呈递和免疫反应启动，间接参与TLS启动。研究表明，凋亡相关的TMEs特征与TLS形成相关。浆细胞通过激活MIF信号通路内的CD74/CD44或CD74/CXCR4复合物来招募B细胞、Tfh细胞和髓系细胞，从而促进TLS的启动阶段。值得注意的是，通过阻断LTβR（TLS启动所需的关键信号组分），肺泡上皮细胞的凋亡被消除。此外，研究还证明凋亡外泌体样囊泡上调IL-17分泌并促进TLS生物发生。
细胞焦亡
细胞焦亡是一种由炎症反应介导的程序性细胞死亡，主要发生在病原体感染、TMEs和自身免疫性疾病的情况下。虽然将细胞焦亡与TLS形成直接联系起来的证据仍然很少，但可以通过共享的炎症通路推断它们之间的潜在关联。细胞焦亡由Gasdermin蛋白介导，这些蛋白诱导膜孔形成并随后释放促炎细胞因子。这些细胞因子可能促进免疫细胞向炎症部位浸润，从而提供可能促进TLS启动的炎症信号。例如，焦亡细胞释放HMGB1蛋白，该蛋白在细胞外作为DAMP，通过TLR4信号传导促进CXCL12的产生。此外，广泛的细胞焦亡发生在牙周炎症中，焦亡细胞释放的IL-1β增强了包括CCL2、CCL5、CXCL5和CXCL12在内的趋化因子的表达。
其他
除了上述细胞死亡模式外，其他形式也可能有助于TLS启动。坏死性凋亡、铁死亡和铜死亡，作为不同类型的细胞死亡或应激反应，可能通过调节炎症、抗原呈递和免疫细胞招募来参与TLS启动。
TLS启动中的细胞相互作用和信号传导
如前所述，TLS的启动阶段不仅依赖于经典的LTα1β2–LTβR通路，还涉及多个信号网络的协同激活。本节重点介绍启动阶段涉及的细胞相互作用和信号通路。TLS启动的因果证据和关联证据进行了区分和分层总结。
LTi–LTo核心轴
LTi细胞作为TLS形成的核心启动者。通过分泌LTα1β2和TNF，它们与LTo细胞上的LTβR和TNFR结合，触发级联反应。该过程诱导LTo细胞释放趋化因子和粘附分子，从而建立招募免疫细胞的化学梯度。具体而言，CXCL13动员B细胞，而CCL19和CCL21将DCs和T细胞招募到炎症部位。非经典NF-κB通路的激活相对较慢。值得注意的是，LTo细胞分泌的IL-7和RANKL反向作用于LTi细胞，通过与IL-7R和RANK结合，增强LTi细胞的存活和LTα1β2的表达。这种相互作用形成了“LTi-LTo-LTi”的正反馈回路，确保了信号通路的持续激活和微环境的稳定。
IL-17的协同作用
除了经典的LTα1β2–LTβR和TNF–TNFR通路外，由LTi细胞分泌的IL-17与LTo细胞表面的IL-17R结合，从而进一步放大信号级联。当IL-17结合后，IL-17R激活经典NF-κB通路和丝裂原活化蛋白激酶信号传导，从而促进TLS相关趋化因子的释放。值得注意的是，IL-17信号传导还增强了LTo细胞对LTα1β2–LTβR信号传导的反应能力。因此，IL-17信号传导和LTα1β2–LTβR信号传导协同形成一个正反馈回路，从而增强了TLS微环境的稳定性。
LIGHT–LTβR轴
LIGHT是LTβR的关键配体，通过与LTo细胞上的LTβR结合激活经典NF-κB信号通路。该过程驱动ICAM1和VCAM1的转录上调。此外，LIGHT–LTβR轴参与非经典NF-κB通路，诱导CXCL12的分泌。作为淋巴细胞归巢的关键趋化因子，CXCL12与其受体CXCR4结合，引导B细胞、T细胞和其他免疫细胞向炎症部位迁移。
警报素介导的IL-33/ST2信号传导
除了经典的LTi–LTo相互作用，新出现的证据表明警报素介导的信号传导有助于TLS启动。从应激或受损的基质和内皮细胞释放的IL-33，通过其在LTi样细胞上表达的受体ST2发出信号。IL-33/ST2轴的接合增强了LTi细胞的活化并促进LTα1β2的表达，从而促进了依赖LTβR的基质激活程序。
IFN和IL-1信号的早期启动
IFN是由病毒感染细胞或免疫细胞分泌的细胞因子家族，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。在TLS启动的早期阶段，IFN-I和IL-1协同调节免疫微环境，发挥关键作用。IFN-I与LTo细胞上的干扰素α受体结合，从而激活信号转导子和转录激活子1通路，并诱导趋化因子的分泌。同时，IL-1通过激活NF-κB通路增强LTo细胞的炎症反应，进一步促进CXCL13的分泌。
交叉调节网络
新出现的证据表明，TLS启动并不依赖于单一通路，而是来自多个部分重叠的调节轴的整合。例如，由cGAS–STING通路驱动的内皮细胞和T细胞之间的交叉对话说明了先天免疫感知、趋化因子信号传导和适应性免疫反馈如何协同作用以启动TLS形成。总之，这些发现支持一个基于网络的模型，在该模型中，先天感知、细胞因子信号传导、代谢线索和基质激活被动态整合以调节TLS的启动，而不是作为孤立的线性通路运行。
调节TLS启动的策略
越来越多的证据表明，TLS的存在与各种疾病的免疫微环境密切相关，特别是在癌症、感染和自身免疫性疾病中发挥着重要的预后和治疗作用。如何通过干预策略诱导TLS形成已成为近年来免疫治疗的研究热点。为了对这些调节方法进行结构化比较，下表总结了TLS启动策略的疗效、安全性和免疫微环境兼容性。
细胞因子疗法
细胞因子在TLSs的发育中起着核心调节作用。细胞因子疗法，无论是通过外源性递送还是增强体内特定细胞因子水平，调节免疫细胞的招募、分化和功能。TLS启动与多种细胞因子密切相关：趋化因子对于淋巴细胞迁移至关重要，而淋巴毒素信号通过LTβR激活基质细胞，诱导粘附分子和次级信号介质的表达，从而促进稳定的滤泡样结构的形成。在小鼠黑色素瘤模型中，注射CXCL13和CCL21导致TLS形成显著增加。然而，许多细胞因子在体内稳定性有限，需要重复给药或超生理剂量，这增加了毒性风险和疗效的可变性。为了克服这些限制，正在探索诸如局部递送系统和具有延长半衰期的工程化细胞因子变体等策略，以提高安全性和改善递送精度。
传统疗法
放疗和化疗传统上被视为直接杀死肿瘤细胞的方法，但最近的研究揭示了它们在调节免疫微环境中的重要作用。放疗通过电离辐射诱导DNA损伤和氧化应激，导致ICD。在此过程中，细胞释放DAMPs，激活DCs并增强抗原呈递，从而逐步促进TLS样结构的形成。类似地，化疗药物也可以诱导ICD，从而增强抗原暴露和免疫反应。与此观点一致，在肝细胞癌中，肝动脉灌注化疗已被证明可以显著增强TMEs内的TLS形成。需要强调的是，放疗和化疗对TLS启动的影响通常是剂量和时间依赖性的：低剂量分次放疗被认为更有利于免疫激活，而单次高剂量照射可能导致免疫抑制。然而，过度的细胞毒性暴露也可能损害支持TLS的基质细胞和免疫细胞，限制TLS的诱导和长期的免疫益处；因此，正在探索剂量优化、分次方案以及与免疫疗法相结合等新兴策略，以平衡细胞毒性效应和免疫激活。因此，传统疗法不仅是细胞毒性的方法，还可以通过调节细胞死亡来间接启动TLS形成，为免疫治疗策略提供了新的机会。
细胞疗法
细胞疗法旨在通过外源性细胞移植或工程化细胞修饰来调节免疫微环境，从而启动TLS形成。在这些策略中，基质细胞移植涉及将外源性成纤维细胞样基质细胞引入靶组织，在那里它们直接提供TLS启动所需的趋化因子和粘附分子。CAR-T细胞疗法用CARs修饰T细胞，以高特异性消除靶细胞，同时释放大量细胞因子，从而促进基质细胞和内皮细胞的活化，并间接诱导TLS形成。类似地，CAR-NK细胞疗法通过基因修饰增强NK细胞的靶向能力，使其能够杀死靶细胞，同时进一步促进抗原呈递和淋巴细胞招募。尽管有这些优势，这些方法仍然受到制造复杂性、持久性问题和免疫毒性的限制。新兴的控制激活和局部递送策略旨在提高安全性和可行性。
微生物疗法
微生物由于其固有的免疫原性，被认为是TLS的有效启动者。OVs选择性裂解靶细胞，同时释放大量抗原，其核酸和蛋白质可以被TLRs识别，从而诱导I型干扰素和各种趋化因子以启动TLS形成。然而，O
