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本研究系统阐明了Sortase A (SrtA) 在益生菌植物乳杆菌C8中作为核心调控枢纽的关键作用。通过CRISPR/Cas9技术构建srtA基因敲除株，结合表型与转录组学分析，首次揭示了srtA通过整合细胞壁完整性、AI-2依赖性群体感应（QS）和胞外多糖（EPS）生物合成通路，精密调控细菌黏附与定植能力的分子网络，为设计高定植能力益生菌提供了全新理论依据。
引言
植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）作为一种广泛存在于发酵食品和人体肠道的重要益生菌，其发挥健康功效的基础在于成功定植于宿主肠道。细菌的黏附能力是影响定植的关键因素之一，而这一过程受其表面蛋白的精准调控。Sortase A（SrtA）是革兰氏阳性菌中的一种关键转肽酶，它通过特异性识别并催化含有LPXTG基序的蛋白锚定到细胞壁肽聚糖层，从而增强细菌对宿主的黏附和定植能力。尽管srtA在金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等致病菌的感染过程中作用明确，但其在非致病性益生菌（如植物乳杆菌）中的功能及其与群体感应（QS）、环境适应通路的整合调控机制尚不清晰。
本研究以植物乳杆菌C8（CGMCC No. 30504）为对象，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了srtA基因敲除突变株，并系统评估了该基因缺失对菌株细胞形态、生长代谢、表面特性、胃肠道耐受性、细胞毒性、生物膜形成及肠道上皮细胞黏附能力的影响。同时，结合转录组学测序，在分子层面深入解析了srtA调控菌株环境适应性与益生功能的网络机制。
材料与方法
研究使用的菌株为植物乳杆菌C8，在MRS培养基中厌氧培养。利用同源重组和CRISPR/Cas9系统构建了srtA敲除质粒，并通过电穿孔法将其导入含有辅助质粒pLH01的乳酸菌感受态细胞中，经双抗生素筛选和PCR验证获得srtA敲除株（KO）。同时设置了野生型（WT）和空载体对照株（EV）。
通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察菌株超微结构；绘制生长曲线并测定产酸能力；评估菌株的自聚集率、表面疏水性、胃肠道（模拟胃液SGF和模拟肠液SIF）耐受性以及对Caco-2细胞的细胞毒性。采用结晶紫染色法测定生物膜形成能力，并利用FITC标记结合荧光显微镜观察和定量计算了菌株对Caco-2肠道上皮细胞的黏附率。
转录组学分析方面，对WT、EV和KO菌株进行了RNA测序。使用DESeq2_EBSeq进行差异表达基因（DEGs）分析（筛选标准：校正后P值 < 0.05， |log2FC| ≥ 1），并对DEGs进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以揭示srtA缺失引发的全局性转录重编程。
结果
1. srtA敲除株的成功构建与验证
成功构建了靶向srtA的敲除质粒，并获得了srtA基因被完全删除的突变株。RT-qPCR结果证实，KO菌株中已检测不到srtA的mRNA，而WT与EV菌株间srtA表达无显著差异，证明敲除成功且空载体引入无影响。
2. srtA缺失导致细胞形态与结构异常
SEM和TEM观察显示，WT和EV菌株呈短杆状，形态完整，边界清晰。相比之下，KO菌株细胞严重变形、表面粗糙皱缩、聚集不均。TEM进一步揭示KO菌株细胞膜破损、内部结构紊乱、尺寸异常增大（达2.89 μm），表明srtA在维持植物乳杆菌C8细胞壁结构稳定性中扮演着不可或缺的角色。
3. srtA缺失显著改变菌株功能表型
生长与代谢方面，KO菌株表现出明显的生长迟滞，延迟至10小时才进入指数生长期，且最终培养液pH值（4.4）高于WT（4.1），表明其产酸能力减弱。
表面特性方面，srtA缺失反而显著增强了菌株的自聚集能力和表面疏水性。KO菌株在6小时自聚集率即高达98.68%，并对正己烷、二甲苯和氯仿均表现出超过88%的高疏水性。
环境耐受性方面，KO菌株在模拟胃肠液处理中表现出更高的存活率（胃液处理后为8.04 log CFU/mL），显示出增强的酸和胆汁耐受性。
然而，关键的益生功能严重受损。KO菌株的生物膜形成能力显著降低。更重要的是，其对Caco-2肠道上皮细胞的黏附率（18.14%）显著低于WT（32.66%）和EV菌株（25.31%），荧光显微镜下可见KO菌株的荧光信号分散，游离细菌增多。
4. 转录组学揭示srtA介导的全局性调控网络
转录组分析发现，KO菌株相较于WT产生了2，967个差异表达基因，其中绝大多数为下调基因。层次聚类显示KO组与WT/EV组转录谱明显分离。
GO富集分析表明，差异基因主要集中在分子功能（MF）类别，如代谢酶活性、DNA结合转录调节因子活性等。唯一显著富集的细胞组分（CC）项是质膜，这与观察到的细胞表面特性改变（如自聚集和疏水性增强）一致。
KEGG通路富集分析则突显了KO菌株在代谢上的重编程，显著富集的通路包括双组分信号转导系统、丙酮酸代谢以及氨基糖/核苷酸糖代谢（这对胞外多糖EPS的生物合成至关重要）。其中，双组分系统是广泛参与环境感知和应激反应的重要信号系统。
对特定功能基因集的靶向分析进一步证实：
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细胞壁合成相关基因：包括Mur酶家族成员（murA–murF）在内的26个肽聚糖合成相关基因显著下调，直接印证了细胞壁结构缺陷的表型。
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黏附相关基因：20个与黏附相关的DEGs表达下调，包括Sec分泌系统组件（secA, secY, secE, secG）以及表面互作蛋白基因，这解释了菌株黏附能力下降的分子基础。
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生物膜相关基因：15个与生物膜形成相关的基因表达下调，涉及EPS生物合成（如glgC, glgA, glgP）和群体感应（QS）关键基因luxS（参与AI-2信号分子合成）。这从分子层面揭示了srtA缺失导致生物膜形成能力减弱的机制。
讨论
本研究构建的srtA敲除突变株引发了广泛而深刻的表型与转录组变化，共同强调了srtA在维持益生菌功能多面性中的核心地位。有趣的是，srtA缺失虽增强了菌株的自聚集、疏水性和胃肠道耐受性这些利于在恶劣环境中存活的“生存性状”，但却以牺牲关键的“益生功能”为代价，即黏附能力和生物膜形成能力严重受损。
结构上，srtA缺失破坏了由Mur家族酶催化的肽聚糖合成途径，导致细胞壁完整性丧失，这可能是表面锚定蛋白功能丧失引发的级联细胞包膜应激反应。功能上，Sec分泌系统组分的下调可能导致表面蛋白转运和定位障碍，直接削弱了菌株与宿主细胞的互作能力。调控上，luxS基因的下调暗示AI-2介导的群体感应（QS）通信受损，而glg家族基因的下调则影响了EPS的合成，两者共同导致生物膜结构无法有效构建。
因此，srtA的作用超越了其经典的细胞壁锚定酶功能。它实际上是一个“总指挥”，协同整合了细胞壁结构完整性、环境信号感知（通过双组分系统和QS）以及表面蛋白功能，从而精密调控益生菌在肠道生态位中的定植能力与持久性。srtA的缺失触发了一个跨越结构、功能和调控三个层面的级联失败：结构崩塌导致黏附锚点损坏；转录重编程转向聚集和疏水等补偿性生存策略；QS失调和EPS合成受阻则瓦解了生物膜这一物理屏障。
结论
本研究表明，Sortase A (srtA) 通过一个以细胞壁为中心的调控 triad（三位一体）支配植物乳杆菌C8的黏附：即肽聚糖完整性、生物膜-QS协调以及表面蛋白功能。CRISPR/Cas9介导的srtA敲除引发了一系列级联缺陷：Mur酶依赖性肽聚糖合成的破坏与细胞壁不稳定性相关，可能损害了黏附锚定位点；同时，参与AI-2信号传导的luxS和参与EPS生物合成的glgC/A/P基因受到抑制，与细菌间通讯和生物膜形成受损相关；而疏水性/聚集相关基因的代偿性上调虽增强了胃肠道耐受性，却不可逆地损害了宿主特异性黏附。转录组与功能数据共同证实，srtA是细胞包膜稳态和益生功效不可或缺的整合者。这些机制性见解将srtA的角色从单纯的酶学锚定重新定义为益生菌在胃肠道生态位中维持定植韧性的主调控器。
