揭示苜蓿中华根瘤菌响应植物细胞分裂素的独立于CHASE结构域的新型cAMP信号转导通路：以CyaB与Dxs互作为核心的感知机制

《Journal of Bacteriology》：CHASE-independent cytokinin perception triggers 3′,5′-cAMP signaling in Sinorhizobium meliloti

本研究报道了在模式共生体系（苜蓿-中华根瘤菌）中发现的一种全新信号感知机制：一种缺乏任何已知受体结构域的腺苷酸/鸟苷酸环化酶（AC/GC）CyaB，能够介导细菌对多种植物细胞分裂素（CKs，如iP、tZ、kinetin、6-BAP）的响应，触发3′,5′-cAMP信号级联。该研究不仅通过遗传筛选和代谢谱分析证实了CyaB依赖的cAMP积累，更关键地鉴定出萜类生物合成途径的关键酶——1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（Dxs）——作为CyaB的相互作用伴侣，并首次提出Dxs可能作为“传感器”介导CK感知，从而调控CyaB酶活性的新颖模型。这一发现为理解共生过程中细菌如何解码宿主植物激素信号、精细调控侵染进程提供了全新的分子视角，并暗示该机制在根瘤菌科（Rhizobiaceae）成员中具有保守性，对深入探究植物-微生物互作的信号对话具有重要意义。

　　

引言：共生固氮中的精密信号对话

在豆科植物与根瘤菌的共生固氮体系中，双方通过精密的遗传与代谢调控，最终形成具有固氮能力的根瘤。苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）能够通过一个依赖于3′,5′-环磷酸腺苷（3′,5′-cAMP）的调节通路来抑制植物的二次共生侵染，该通路依赖于含有CHASE2结构域的腺苷酸/鸟苷酸环化酶（AC/GCs），并可能响应一种植物来源的蛋白质信号。植物细胞分裂素（CKs）是调控植物发育多方面（包括共生结瘤）的腺嘌呤衍生物植物激素。经典的植物和细菌CK受体都包含一个CHASE结构域。

结果：植物CKs通过CyaB触发cAMP生物合成

为评估植物CKs对S. melilotiRm2011中cAMP合成的影响，研究采用了基于Clr和cAMP激活的荧光报告系统（pSRKKm-smc02178-EGFP）。研究发现，外源添加异戊烯基腺嘌呤（iP）、反式玉米素（tZ）、激动素（kinetin）和6-苄氨基嘌呤（6-BAP）均能导致增强的绿色荧光蛋白（EGFP）荧光，而生长素吲哚-3-乙酸（IAA）则无此效应。其中，iP的效应最强，与添加200 μM cAMP的效果相当，且呈剂量依赖性。

通过筛选一系列AC/GC基因缺失突变体，研究人员发现只有?cyaB菌株对iP的响应能力严重减弱，而添加cAMP仍可激活报告基因。回补cyaB基因可以恢复这种响应，表明iP存在下CyaB介导的cAMP生物合成被激活。靶向质谱分析进一步证实，在300 μM iP诱导下，野生型Rm2011细胞内cAMP水平增加了约两倍，同时ATP水平下降，而在?cyaB突变体中未观察到cAMP的显著增加。

CyaB响应iP的能力在根瘤菌科中保守

研究选取了具有植物致病性（Agrobacterium fabrum）、植物共生性（Rhizobium johnstonii）和非植物关联（Ensifer adhaerens）生活方式的根瘤菌科代表物种。将这些物种的cyaB直系同源基因导入S. meliloti ?cyaB菌株后，发现除E. adhaerens的CyaB_Ea仅引起中等程度的响应增强外，CyaB_Af和CyaB_Rj均能介导强烈的iP响应，表明这一功能在根瘤菌科中是保守的，且可能与植物关联的生活方式存在相关性。

iP信号感知不依赖于cyaB邻近基因、pSymA大质粒或含有CHASE结构域的环二鸟苷酸合酶

CyaB本身不含任何已知的感觉结构域，仅包含一个N端跨膜结构域和一个C端胞质催化结构域（ACYC）。遗传分析表明，缺失共生必需大质粒pSymA、缺失所有环二鸟苷酸合酶/磷酸二酯酶基因（包括两个含有CHASE结构域的酶），或缺失cyaB邻近的六个基因，均未完全消除iP介导的报告基因荧光响应。这提示感知机制可能独立于这些因子。

CyaB及其直系同源物与MEP/DOXP途径蛋白Dxs相互作用

为直接寻找CyaB的潜在互作伴侣，研究进行了免疫共沉淀（CoIP）结合质谱分析。无论在有无iP的条件下，胞质蛋白1-脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP）合酶（Dxs）始终是CyaB-3xFLAG样本中排名最高的互作蛋白，而在空载体对照样本中未检测到。Dxs催化甘油醛-3-磷酸（G3P）和丙酮酸合成DXP，是甲羟戊酸（MEP）/脱氧木酮糖磷酸（DOXP）途径中合成硫胺素、吡哆醇和萜类骨架的关键前体。

代谢谱分析显示，iP处理导致野生型和?cyaB细胞中DXP的前体DHAP和G3P水平轻微下降，而下游产物二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）水平增加了20%以上。值得注意的是，仅缺失cyaB本身也会导致DMAPP水平增加约30%，这暗示CyaB可能影响Dxs的功能。

细菌双杂交（BTH）分析验证了失活的CyaB变体（CyaB*）与Dxs之间存在相互作用，并且这种相互作用在来自A. fabrum、R. johnstonii和E. adhaerens的CyaB直系同源物中也存在。AlphaFold3算法预测的蛋白质复合物模型显示，Dxs-CyaB的相互作用界面靠近CyaB的活性位点，其中CyaB的R284残基（属于III类核苷酸环化酶的保守核苷酸结合位点基序）可能与Dxs的V242残基相互作用，这为Dxs调节CyaB酶活性的分子机制提供了线索。

讨论：一种全新的CK感知模型

本研究发现了一条由CyaB介导的、独立于经典CHASE结构域受体的植物CK感知通路。尽管iP和tZ结构高度相似，但iP在触发cAMP响应方面比tZ强约10倍，这可能与两者在植物体内的合成部位、运输途径及生物学功能特异性有关。

研究结果表明，CyaB与Dxs的相互作用在有无iP的情况下均存在。鉴于iP的侧链与DMAPP完全相同，一个合理的假设是：iP可能与DMAPP竞争结合Dxs，从而解除DMAPP对Dxs的反饋抑制。Dxs构象的变化可能进一步传递给其互作伴侣CyaB，促进CyaB的AC活性，最终导致cAMP合成增加并激活Clr调节子，实现对共生过程的调控。

综上所述，这项研究揭示了一种前所未有的分子机制，即共生细菌通过其核心代谢途径的一个关键酶（Dxs）作为“协同传感器”，来感知宿主植物的激素信号（CKs），并将该信号转换为第二信使cAMP的变化。这一发现不仅扩展了我们对细菌环境感知和信号转导复杂性的认识，也为深入理解植物-微生物共生体系中双向化学对话的精细调控开辟了新的研究方向。