《Journal of Virology》：Marine medaka PKCα promotes red-spotted grouper nervous necrosis virus entry by orchestrating MYL3-mediated macropinocytosis and cofilin-dependent actin remodeling
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本研究揭示了海洋青鳉PKCα（MmPKCα）在红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）入侵宿主细胞中的关键作用。研究发现，RGNNV感染激活MmPKCα，其通过C端结构域与病毒衣壳蛋白（CP）和宿主蛋白Cofilin（MmCFL1/2）互作，并抑制Cofilin的Ser3位点磷酸化，从而激活Cofilin并驱动肌动蛋白骨架重排。这一过程将已知病毒受体MmMYL3介导的巨胞饮作用与下游的信号转导和细胞骨架动态变化联系起来，构成了全新的“MmMYL3-MmPKCα-Cofilin”信号轴。该研究不仅阐明了鱼类病毒入侵的新机制，也为以PKCα为靶点开发抗病毒神经坏死症（VNN）的控制策略提供了理论依据。
MmPKCα被RGNNV激活并促进病毒入侵
为探究MmPKCα在RGNNV感染中的潜在作用，研究人员首先分析了其在受感染细胞中的表达动态。定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析显示，感染后宿主细胞中MmPKCα的mRNA水平显著上调，并在感染后4小时（hpi）达到峰值。蛋白质印迹法进一步证实，RGNNV感染不仅增加了MmPKCα的总蛋白水平，还特异性增强了其Thr496位点（一个关键的激活环残基）的磷酸化，表明RGNNV诱导了MmPKCα的激活。
功能研究证实了MmPKCα活性对病毒入侵的影响。使用PKC激活剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）处理细胞或异位表达MmPKCα，均能显著增加感染后2小时和4小时RGNNV衣壳蛋白（CP）mRNA的水平。相反，使用Go 6983药物抑制PKC，或通过小干扰RNA（siRNA）敲低MmPKCα，则能显著降低病毒CPmRNA的水平。为了确认MmPKCα激酶活性的重要性，研究人员构建了MmPKCα的磷酸化缺陷突变体（T496A, T637A, S656A）。任何一个单点突变都削弱了MmPKCα增强CP表达的能力。这些结果共同证明，RGNNV激活了MmPKCα，而MmPKCα以激酶活性依赖的方式促进RGNNV的入侵。
MmPKCα通过其C端结构域与RGNNV CP互作
在确定MmPKCα促进RGNNV入侵后，研究人员探索了这一促病毒功能的分子基础。考虑到CP是病毒唯一的衣壳蛋白并介导病毒入侵，他们研究了MmPKCα与CP之间潜在的相互作用。引人注目的是，单独过表达CP就足以提升MmPKCα的蛋白水平及其Thr496位点的磷酸化，表明RGNNV可能通过其CP激活MmPKCα。免疫荧光（IF）显示，MmPKCα和CP蛋白在HEK293T细胞的细胞质中共定位。免疫共沉淀（Co-IP）证实了MmPKCα和CP蛋白之间存在双向结合。此外，研究发现它们的相互作用不依赖于MmPKCα的磷酸化状态，因为磷酸化缺陷的三重突变体（T496A/T637A/S656A）仍然能与CP结合。
为了确定相互作用的界面，研究人员构建了MmPKCα和CP的一系列截短突变体。Co-IP实验表明，MmPKCα的C端（CT）结构域是与CP结合所必需的，其缺失（ΔCT）完全消除了相互作用，而其他结构域的缺失则没有影响。相比之下，CP中任何单一结构域的缺失都不会破坏其与MmPKCα的结合，这表明CP通过多位点或构象界面与MmPKCα结合。
MmPKCα不是RGNNV的受体
MmPKCα与CP之间强有力的相互作用促使研究人员探究MmPKCα本身是否作为RGNNV的细胞表面受体。对非透化细胞的免疫荧光分析证实，一部分MmPKCα定位于质膜，并且这种表面相关的部分在RGNNV感染或CP过表达后有所增加。然而，功能实验论证了MmPKCα并非受体。首先，过表达或敲低MmPKCα均不影响RGNNV病毒颗粒在4°C下与宿主细胞的结合。其次，与已知的受体MmMYL3不同，过表达MmPKCα未能使原本不易感的HEK293T细胞变得允许RGNNV入侵。同样，加入MmPKCα并未显著影响MmMYL3的增强效应。第三，将病毒与重组MmPKCα蛋白预孵育，或用抗PKCα抗体预处理细胞，均未能阻断病毒入侵。这些结果证实MmPKCα是作为一种信号辅助因子而非病毒受体发挥作用，其通过附着后机制发挥促病毒效应。
MmPKCα通过MmMYL3介导的巨胞饮作用促进RGNNV入侵
既然MmPKCα不是受体但能促进RGNNV入侵，研究人员假设其作用于已知的RGNNV受体MYL3下游，该受体通过巨胞饮作用介导RGNNV入侵。使用Alexa Fluor 647标记的葡聚糖作为巨胞饮示踪剂，研究发现RGNNV感染强烈刺激了宿主细胞中的巨胞饮作用。在MmMYL3过表达的细胞中，RGNNV诱导的葡聚糖摄取可被Go 6983处理或MmPKCα敲低有效抑制，这表明MmPKCα是RGNNV触发巨胞饮作用所必需的成分，并且MYL3的促入侵功能依赖于MmPKCα。研究人员随后探究了MmPKCα与MmMYL3的关系。MmMYL3过表达增加了MmPKCα的总蛋白水平和Thr496磷酸化，提示MmMYL3信号传导激活了MmPKCα。免疫荧光和免疫共沉淀实验证明了MmPKCα与MmMYL3之间存在相互作用，这通过GST pull-down实验得到了进一步确认。这些数据将MmPKCα定位为MmMYL3受体的关键下游信号效应子，对于执行RGNNV的巨胞饮入侵至关重要。
MmPKCα通过其CT结构域抑制Cofilin磷酸化以促进肌动蛋白重排
巨胞饮作用依赖于肌动蛋白细胞骨架的重排，而Cofilin是肌动蛋白动态的关键调节因子。因此，研究人员探究了MmPKCα是否调节Cofilin的活性。首先，使用iFluor-488-phalloidin进行免疫荧光染色显示，PMA处理能诱导宿主细胞发生强烈的肌动蛋白重排，而Go 6983处理则没有效果，这提示了MmPKCα激活与肌动蛋白动态之间的关联。接下来，他们分析了MmPKCα与Cofilin之间的相互作用。MmPKCα在HEK293T细胞中与MmCFL1和MmCFL2均存在共定位。免疫共沉淀显示，MmPKCα通过其催化结构域（CD）和C端结构域（CT）与MmCFL1/MmCFL2相互作用；缺失任一结构域都会消除结合。此外，MmPKCα过表达以剂量依赖的方式促进了HEK293T细胞中MmCFL1和MmCFL2的表达。更重要的是，功能实验表明，Go 6983增加了Cofilin Ser3位点的磷酸化（非活性形式），而PMA则促进了Cofilin的去磷酸化（活性形式），这表明MmPKCα抑制了Cofilin Ser3的磷酸化以维持其切割肌动蛋白的活性。最后，研究人员测试了MmPKCα结构域在调节Cofilin中的作用。MmPKCα磷酸化位点的突变对Cofilin Ser3磷酸化没有影响。然而，缺失MmPKCα的CT结构域，而非CD结构域，则使其抑制Cofilin磷酸化的能力丧失。这些结果表明，MmPKCα的CT结构域对于结合Cofilin并抑制其Ser3磷酸化至关重要，从而促进了巨胞饮作用所需的肌动蛋白重排。
讨论与模型
病毒入侵是感染成功的关键决定因素。本研究阐明了RGNNV利用来入侵宿主细胞的新信号轴。研究数据支持一个模型：RGNNV通过其CP与MmMYL3受体结合，导致MmPKCα被募集和激活。激活的MmPKCα随后直接与Cofilin相互作用并促进其去磷酸化，最终引发肌动蛋白驱动的膜皱褶和巨胞饮作用，从而将RGNNV推入宿主细胞。这一级联反应阐明了RGNNV入侵的分子机制，并凸显了PKCα作为硬骨鱼类中细胞表面受体MmMYL3与细胞内肌动蛋白重塑机制之间关键连接点的作用。
PKCα是经典的PKC成员，在多种哺乳动物病毒的入侵中已有记载，但其在硬骨鱼类病毒中的功能此前仍不清楚。本研究发现，RGNNV主动上调并磷酸化MmPKCα，且其激酶活性对于高效的病毒入侵不可或缺。值得注意的是，MmPKCα通过其CT结构域直接与RGNNV CP相互作用；该相互作用不依赖于PKCα的磷酸化状态。这种病毒-宿主蛋白相互作用可能有助于MmPKCα的激活，因为仅CP过表达就足以诱导MmPKCα磷酸化。然而，尽管MmPKCα定位于细胞表面并与MmMYL3相互作用，全面的受体验证实验（包括未改变的病毒结合、无法使非易感细胞变得允许、以及抗体或重组蛋白无法中和）最终证明MmPKCα是信号辅助因子而非结合受体，这解释了其在不影响初始病毒附着的情况下促进入侵的能力。
巨胞饮作用是一种独特的胞吞途径，与病毒诱导的显著的细胞范围质膜皱褶有关，这个过程依赖于多种激酶的协同作用。先前的研究表明，PKC抑制剂可以减少由病毒感染引起的巨胞饮作用。本研究的发现揭示，无论是药物抑制PKC还是敲低MmPKCα，都能有效减弱RGNNV诱导的巨胞饮作用。研究人员先前已确定MmMYL3是RGNNV的受体，其专门通过巨胞饮作用介导入侵，但将MmMYL3与巨胞饮执行机制连接起来的信号事件尚不清楚。本研究显示，MmMYL3直接与MmPKCα相互作用并通过Thr496磷酸化激活它，并且MmMYL3增强RGNNV入侵的能力依赖于PKC活性。这些发现确立了MmPKCα作为MYL3的关键下游效应子，将受体结合与巨胞饮作用的执行连接起来。PKC抑制剂显著阻断MmMYL3增强感染的能力这一事实强调了该受体的促病毒功能是通过PKCα信号传导实现的。
肌动蛋白细胞骨架重排是巨胞饮作用的机械驱动者，而Cofilin是这一过程的主调节因子。Cofilin的肌动蛋白结合活性通过其保守的Ser3位点的磷酸化（失活）和去磷酸化（激活）来控制，而PKCs已被认为是影响这一过程的有效调节因子。此外，PKCδ-Cofilin信号通路在病毒诱导的巨胞饮作用中发挥调节作用。为了探究MmPKCα是否与Cofilin具有相似的功能，研究人员首先确认了MmPKCα与MmCFL1和MmCFL2的相互作用。PKCα含有一个维持酶处于非活性构象的调节结构域，其催化结构域能够磷酸化适当的底物以进行进一步的下游处理。本研究结果显示，属于MmPKCα催化结构域的CD和CT结构域的缺失会消除其与MmCFL1和MmCFL2相互作用的能力，表明CD和CT结构域对于MmPKCα与Cofilin的相互作用至关重要。除了MmPKCα与Cofilin的相互作用外，研究结果还显示，MmPKCα增强了外源性和内源性MmCFL1和MmCFL2的表达，同时抑制了Cofilin的磷酸化，从而促进了Cofilin的肌动蛋白切割活性。值得注意的是，研究结果显示，MmPKCα中T497、T637和S656的突变并未显著诱导Cofilin Ser3的去磷酸化。然而，CT结构域的缺失则显著抑制了Cofilin的去磷酸化。考虑到T637和S656都位于CT结构域内，这些结果表明MmPKCα介导的Cofilin活性调节可能依赖于CT结构域本身或T637和S656的协同磷酸化。在哺乳动物系统中，Cofilin Ser3的磷酸化受到激酶（如LIMK、TESK）和磷酸酶（如SSH）平衡的严格控制。将这种保守的调控框架扩展到硬骨鱼类，研究人员提出了MmPKCα CT结构域功能的两种非互斥模型：其一，CT结构域可能直接与SSH或其上游调节因子相互作用，促进SSH募集至Cofilin并增强其去磷酸化；其二，CT结构域可能立体阻碍LIMK或TESK接近Cofilin，从而减少Ser3磷酸化。未来的研究将通过探究MmPKCα CT结构域与Cofilin磷酸化/去磷酸化机制关键组分在海洋青鳎中的相互作用来验证这些假说。
值得注意的是，目前的PKC抑制剂缺乏亚型特异性，限制了其体内应用和治疗潜力。本研究确定了MmPKCα的CT结构域是一个双功能模块：它介导与RGNNV CP的相互作用并调节Cofilin的磷酸化。这种双重作用使得CT结构域成为开发亚型特异性抑制剂的一个有前景的靶点。与广谱PKC抑制剂不同，靶向CT结构域的制剂将选择性地破坏MmPKCα依赖的RGNNV入侵，而不干扰其他PKC亚型或宿主的内吞稳态。
总而言之，本研究揭示了MmPKCα通过全新的“MmMYL3-MmPKCα-Cofilin”信号轴促进RGNNV入侵。作为RGNNV受体MmMYL3的关键下游效应子，MmPKCα通过结合Cofilin（MmCFL1/2）并抑制其Ser3磷酸化来驱动肌动蛋白重排，从而促进MmMYL3介导的巨胞饮作用。这些发现确立了MmPKCα在RGNNV感染中的关键信号枢纽地位，并为其作为抗病毒神经坏死症（VNN）策略的潜在治疗靶点提供了依据。
