当替代方案变得至关重要时：线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶的作用

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：When alternative becomes essential: The role of mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase

线粒体G3P脱氢酶（mtG3PDH）突变导致果蝇生存率下降、运动能力受损，主要因ATP生产减少（60%）和氧气消耗降低（33%），而非氧化应激增加，证实其在线粒体生物能和氧化还原稳态中的关键作用。

　　

摘要

复合体I被认为是线粒体电子传递系统（ETS）中电子的主要入口点。然而，甘油-3-磷酸（G3P）穿梭系统由细胞质中的G3P脱氢酶（cG3PDH）和线粒体中的G3P脱氢酶（mtG3PDH）组成，它将还原当量从细胞质转移到线粒体基质中。mtG3PDH通过FADH₂的氧化将电子传递给ETS，但其能量转换效率理论上低于复合体I。因此，它被认为是一种“替代”途径，仅在复合体I失效时才支持线粒体呼吸。mtG3PDH在活性氧（ROS）的产生中也起着重要作用。为了研究这种研究不足的蛋白质在线粒体生物能量学和氧化还原稳态中的作用，我们使用CRISPR/Cas9方法生成了黑腹果蝇的mtG3PDH（GPO1）突变体系，并确定了几个生理和代谢参数。观察到GPO1果蝇的死亡率显著升高，同时表现出嗜睡行为，表现为无法攀爬。这些结果与线粒体效率受损一致（ATP/O降低约60%和O₂消耗降低约33%），而不是ROS升高。实际上，GPO1果蝇产生的ROS比对照组少约70%，这可能是由于mtG3PDH直接和逆向电子传递相关的ROS产生减少所致。这些结果支持mtG3PDH在线粒体生物能量学中的关键作用，挑战了其作为替代途径的观点，并证实了其在线粒体氧化还原稳态中的重要性。

线粒体通过电子传递系统（ETS）驱动的氧化磷酸化过程（OXPHOS）产生ATP。电子进入ETS是通过多个复合体实现的，这些复合体可以氧化NADH连接的底物（复合体I–CI）或FADH₂连接的底物（复合体II–CII、线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶–mtG3PDH、电子传递黄素蛋白等），其可用性取决于底物供应以及细胞或环境信号，这一过程被称为线粒体灵活性^(a)。CI被广泛认为是主要的电子入口点，它将线粒体NADH的氧化与质子泵送耦合起来，支持大部分ATP的合成^(a)。相比之下，FADH₂替代途径不直接泵送质子，表明它们可能具有其他代谢或调节功能。

其中，甘油-3-磷酸（G3P）穿梭系统^{(a)Fig. 1A}通过两种酶将细胞质中的NADH转化为线粒体中的FADH₂：i) 细胞质中的G3P脱氢酶（cG3PDH），它使用细胞质中的NADH将糖酵解产生的二羟基丙酮磷酸（DHAP）转化为G3P；ii) 位于线粒体内膜外的mtG3PDH^(a)，它将G3P氧化回DHAP，同时通过FADH₂氧化为FAD将电子传递给ETS中的泛醌（Q）^(a)。由于mtG3PDH产生的ATP较少（每FADH₂产生1.5个ATP），而NADH相关途径产生2.5个ATP，特别是与苹果酸-天冬氨酸穿梭系统相比^(a)，mtG3PDH常被称为“替代”电子入口点。然而，新的证据表明，在CI受损的情况下，尤其是在昆虫饮食变化或温度升高等线粒体不灵活的情况下，mtG3PDH在支持线粒体呼吸中起着关键作用^{(a), (b)}。

图1.

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GPO1果蝇的基因改造成功降低了mtG3PDH的酶活性，而没有影响cG3PDH的活性。(A) G3P穿梭系统的示意图。使用BioRender?创建。(B) 控制组（CTRL）和CRISPR编辑组（GPO1）果蝇之间的Gpo1编码序列比对（详见补充信息。(C) 有或没有mtG3PDH抑制剂iGP-1时的mtG3PDH酶活性。不同字母表示不同品系和实验组之间的显著差异（n = 5至6）。(D) cG3PDH的酶活性（n = 5至6）。

除了在将电子穿梭到线粒体中的作用外，mtG3PDH还在活性氧（ROS）的产生中起着重要作用，从而影响线粒体的氧化还原状态^{(a), (b)}。首先，当mtG3PDH将FADH₂氧化为FAD时，它在线粒体内膜的两侧产生O₂^•-。此外，高水平的mtG3PDH活性可以驱动逆向电子传递（RET），通过促进泛醌的过度还原，迫使电子逆流回ETS的CI_q位点，从而增加CI_q处的ROS产生^(a)。

尽管mtG3PDH对能量和氧化还原稳态有明显的贡献，但它仍然被研究得很少。为了进一步研究这一复合体的功能，我们使用CRISPR/Cas9突变技术在编码mtG3PDH的甘油磷酸氧化酶1（Gpo1）基因中生成了黑腹果蝇突变体系（GPO1）^(a)。通过酶活性测定和测序确认了特异性修饰^{(a), (b)}。在10天大的雄性果蝇中测量了对照组（CTRL）和GPO1系的存活率和攀爬能力。还收集了相同年龄的果蝇，从胸部分离线粒体以测量在不同条件下的ATP产生、线粒体氧气消耗和H₂O₂排放率。

结果与讨论

GPO1果蝇的存活率显著降低（对数秩χ² = 170，P < 0.001；图2A），中位寿命为12天，而对照组为33天。GPO1果蝇还表现出严重的运动障碍，只有1%的个体能在30秒内爬到试管顶部^{(P < 0.001；}图2），而对照组为68.5%。

图2.

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mtG3PDH的突变严重损害了果蝇的存活率和攀爬能力。(A) 存活曲线：数据通过对数秩测试分析（n = 120）。虚线表示每个品系的中位寿命。(B) 攀爬能力：数据为平均值±标准误差。***表示两组果蝇之间的显著差异（n = 10个试管）。

与这些表型一致，GPO1果蝇的线粒体功能严重受损。总体ATP产生显著减少^{(P < 0.001；图3A}），主要是由于mtG3PDH的贡献减少^{(P < 0.001；图3}），而CI的贡献保持不变^(a>图3。同样，在CI+CII+mtG3PDH驱动的OXPHOS过程中，GPO1果蝇的氧气消耗也显著降低^{(P < 0.01；图3}，这再次是由于G3P对线粒体呼吸的贡献减少^{(P < 0.001；图3}）。CI的耦合效率仅略有影响^{(P < 0.05；图3}）。

图3.

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mtG3PDH（GPO1）的突变影响了线粒体的生物能量学和氧化还原状态。(A)–C 复合体I（CI）、复合体II（CII）和mtG3PDH联合（CI+CII+mtG3PDH）的ATP产生；(B) mtG3PDH和（C）CI；(D) CI+CII+mtG3PDH-OXPHOS过程中的氧气消耗率；(E) G3P对线粒体O₂消耗的贡献；F 复合体I的耦合比率；G 当CI、CII和mtG3PDH都被激活时计算出的线粒体效率ATP/O比率（来自和D）；H–K 在CI+CII+mtG3PDH、I CII+mtG3PDH、J CII和K mtG3PDH条件下测量的H₂O₂排放率。星号表示两组果蝇之间的显著差异（n = 6至9）（P < 0.01**；P < 0.001***）。

综合来看，ATP产生和O₂消耗被用来计算线粒体效率（ATP/O），当CI、CII和mtG3PDH都被激活时（即来自图3A和D的结果），在GPO1果蝇中明显降低^{(P < 0.001；}图3G）。这清楚地表明ATP产生和氧气消耗之间的耦合受损，与GPO1果蝇观察到的严重运动缺陷和存活率下降一致。这共同证明了mtG3PDH在维持线粒体生物能量学和整体生理过程中的关键作用。

关于ROS的产生，当提供CI、CII和mtG3PDH的底物时（CI+CII+mtG3PDH，P < 0.001；图3H），GPO1果蝇的H₂O₂排放显著减少^(a)；即使不提供CI时（CII+mtG3PDH，P < 0.01；图3I），也是如此。这种减少是由于mtG3PDH在其通常起重要作用的两个位点上的ROS产生贡献显著减少：直接在mtG3PDH位点^{(P < 0.01；}图3J）和在CI_q位点（在CII+mtG3PDH条件下得到支持^{(a>图3I）。因为在存在罗丹宁的情况下测量了mtG3PDH相关的排放率以抑制CI介导的逆向电子传递，这些值可能代表了mtG3PDH的完整ROS产生能力的保守估计。相比之下，CII来源的H₂O₂排放在不同品系之间没有差异(a>图3K）。这些结果显示了mtG3PDH在线粒体氧化还原状态中的主要作用。尽管mtG3PDH的损伤可能导致较少的氧化损伤，但它也可能损害关键的线粒体更新途径（如凋亡和生物发生）的ROS信号传导(a)，从而导致GPO1果蝇的存活率降低。}

总体而言，这些结果推翻了mtG3PDH仅仅作为替代途径的观点，而是确立了它作为线粒体功能和存活的关键决定因素。这些发现扩展了mtG3PDH的相关性，表明其在线粒体生理学中具有更广泛的作用，并强调了它通过多种途径实现其功能的能力^(a)。此外，它对线粒体生物能量学的影响可能扩展到其他重要的细胞过程，因为这种蛋白质与人类的多种病理状况有关，如神经系统疾病、代谢疾病和癌症^(a>11–14）。

材料与方法

详细的方法和统计分析在补充信息中有描述。