《Applied Biological Chemistry》：Evaluation of plant-expressed human PD-1 as an immunogen capable of inducing native PD-1 recognizing antibodies
编辑推荐：
本文通过一项原创性研究，评估了利用本氏烟（Nicotiana benthamiana）植物平台表达人程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的潜力。研究比较了植物、细菌（E. coli）和哺乳动物（HEK293T细胞）三种表达系统所产PD-1的生化特性与免疫原性。结果表明，尽管植物源PD-1主要存在于不溶性组分且需变性纯化，但其仍可诱导产生能识别天然细胞表面PD-1的抗体，虽然效力低于哺乳动物细胞来源的抗原。该研究为利用植物系统生产治疗性抗体开发的靶向抗原提供了新的思路和可行性依据。
植物源人PD-1的表达与优化
为了开发治疗性单克隆抗体，选择合适的靶抗原并制备高质量的抗原至关重要。程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）是一种关键的免疫检查点受体，是抗体药物开发的重要靶点。本研究旨在建立一个基于植物的平台来生产人PD-1，并评估其生化性质和免疫原性潜力。
研究首先对PD-1基因进行了密码子优化，使其更适应本氏烟（Nicotiana benthamiana）的密码子使用偏好。优化后，相对于烟草（Nicotiana tabacum）的密码子适应指数（CAI）从0.55提高到了0.95，这预示着其在植物中表达兼容性的显著改善。随后，研究团队利用两种农杆菌介导的植物表达载体——pFM′M和pRI101，分别由FM′M启动子和花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子驱动，在本氏烟叶片中进行了PD-1的瞬时表达。结果显示，pFM′M载体驱动的PD-1表达水平高于pRI101载体。
为了进一步优化表达，研究人员评估了多种因素对蛋白产量和可溶性的影响。与RNA沉默抑制子p38相比，共表达p19显著提高了PD-1的积累水平。此外，叶片发育阶段对表达水平有强烈影响，从中部（如位置3）叶片中获得了最高的PD-1表达量。然而，在评估蛋白质溶解性时发现，尽管使用了不同浓度的非离子去污剂Triton X-100和Tween-20进行处理，植物表达的PD-1仍主要积累在不溶性的沉淀组分中，表明其在植物细胞内倾向于聚集或形成包涵体样结构。因此，需要使用部分或完全变性的条件进行纯化。
PD-1蛋白的纯化与产率
鉴于植物表达的PD-1主要存在于不溶性部分，研究采用变性条件，通过镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析对蛋白质进行了纯化。通过密度计量法估算，从10克新鲜叶片组织中可获得约50微克的纯化PD-1，这相当于每克鲜重约5微克的产量。为了比较免疫原性，研究还利用大肠杆菌（E. coli）表达了PD-1的胞外域（残基1–167），并纯化了去除信号肽的成熟蛋白形式（残基25–167），以代表生理相关的细胞表面形式，用于后续的免疫学分析。
植物、细菌和哺乳动物来源PD-1抗原的免疫激活能力比较
为了评估免疫原性，研究人员用植物、细菌或哺乳动物细胞产生的PD-1蛋白免疫了BALB/c小鼠。每组小鼠接受等摩尔剂量（25、75或125皮摩尔）的纯化抗原，并辅以弗氏佐剂。血清样本在特定间隔期收集用于免疫学分析。
结果显示，用植物源PD-1免疫的小鼠在所有抗原剂量下都表现出明显的脾脏增大，其程度与细菌源PD-1免疫的小鼠相当，并超过了哺乳动物细胞源PD-1免疫的小鼠。同时，也观察到了淋巴结的增大，这表明植物源PD-1能有效刺激适应性免疫反应。这些结果共同表明，植物源PD-1诱导的免疫反应可与传统的细菌或哺乳动物表达系统产生的抗原相媲美，支持了植物源PD-1作为治疗性抗体开发功能性免疫原的适用性。
植物源PD-1抗原在小鼠模型中的免疫原性评价
为了比较植物、细菌和哺乳动物表达系统产生的PD-1抗原所引发的体液免疫反应，研究人员通过酶联免疫吸附试验（ELISA）分析了每次免疫后收集的系列血清样本。抗体结合活性评估使用的是大肠杆菌纯化的PD-1片段（残基25–167）作为包被抗原。初次免疫后，植物源PD-1诱导产生了强烈的抗体生成，与细菌源PD-1相当，而哺乳动物细胞源PD-1的抗体反应则明显较弱，这与观察到的脾脏和淋巴结增大结果一致。加强免疫后，植物源PD-1免疫小鼠的血清仍表现出高结合活性，虽然略低于细菌源PD-1诱导的反应，但超过了哺乳动物细胞源PD-1。通过ELISA吸光值拟合曲线定量计算了各组半数最大效应浓度（EC50）滴度。植物源PD-1的EC50值在1.8×10–4到6.7×10–5之间，而细菌源PD-1的EC50值更低（在2.2×10–5到3.5×10–5之间），表明其抗体结合效力大约是植物源PD-1的三倍。
植物、细菌或哺乳动物源抗原诱导的抗体对天然PD-1的识别能力
为了测试植物源PD-1诱导的抗体是否能识别天然PD-1蛋白，研究通过ELISA和流式细胞术分析了第三次免疫后收集的血清样本。抗体结合活性使用哺乳动物细胞源PD-1作为包被抗原进行检测。EC50分析显示，植物源PD-1免疫小鼠的血清EC50值在8.9×10–4到1.2×10–4之间，细菌源PD-1免疫小鼠的血清EC50值在9.2×10–4到1.0×10–4之间，而哺乳动物细胞源PD-1免疫小鼠的血清显示出更低的EC50值（在4.8×10–5到6.9×10–5之间），反映了最高的抗体结合效力。
为了进一步评估抗体功能，研究进行了基于流式细胞术的结合实验。使用转染了PD-1-GFP（绿色荧光蛋白）质粒的LR73细胞，确认了PD-1-GFP的表达。植物源PD-1免疫小鼠的血清与23%和17.4%的PD-1表达细胞结合。细菌源PD-1诱导的抗体结合率略高，标记了31.7%和33.2%的细胞。这些结果表明，植物源和细菌源PD-1抗原能够产生能够识别天然、细胞表面PD-1的功能性抗体。相比之下，哺乳动物细胞源PD-1免疫小鼠的血清诱导了显著更高水平的PD-1特异性抗体，结合率高达95.8%和85.7%。
讨论与展望
植物基重组蛋白系统已成为生产复杂真核蛋白（如抗体、细胞因子和疫苗抗原）的替代表达系统。本研究开发了用于生产人PD-1的植物表达平台，并评估了其在治疗性抗体开发中的表达特性、纯化行为和免疫原性潜力。由于抗体识别高度特异的三维表位，因此抗原的生物化学质量、构象和翻译后修饰是诱导产生具有高亲和力和功能相关性抗体的关键决定因素。本研究中，尽管植物源或细菌源PD-1免疫小鼠的血清中含有能与PD-1表达细胞结合的抗体，但其效力弱于哺乳动物细胞源PD-1免疫小鼠的血清。一个关键差异在于，植物源或细菌源PD-1是在变性条件下纯化的。未来的成功可能需要一种能在天然状态下纯化蛋白质的方法。
近年来植物基纯化策略的进展可能为克服这些限制提供了途径。值得注意的是，源自革兰氏阳性乳酸菌的天然肽聚糖纳米颗粒（NPNs）已成为纯化和递送植物生产重组蛋白的有前景工具。一项近期研究表明，优化的NPN处理（包括三氯乙酸和胰蛋白酶处理）可以有效去除污染性亚细胞成分，同时保留纳米颗粒强大的蛋白质结合能力。重要的是，当与植物源抗原结合时，NPNs能够在温和、非变性的条件下实现纯化，并在体内支持强大的体液免疫反应。这些发现表明，将基于NPN的纯化方法与我们的PD-1表达平台整合，可能有助于从植物中回收正确折叠、可溶的PD-1抗原，从而解决本研究中观察到的主要局限性——在变性纯化过程中天然构象的丧失。通过实现低温下的温和蛋白质捕获和稳定，NPN介导的方法可能有助于保持表位完整性，并增强与常规变性工作流程相比的免疫原性。
作为自养生物，植物利用光、水和最少的营养输入合成复杂的生物分子，减少了对昂贵培养基的依赖，并实现了节能生产。这种生物能力也支持了真核蛋白在内源性质量控制途径内的正确折叠和翻译后修饰，相较于通常需要大量工程改造才能实现可比分子复杂性的微生物系统，提供了固有的优势。受控环境植物培养的可扩展性和环境适应性进一步增强了植物分子农业的实用性。重组蛋白可以在完全封闭的室内系统中生产，使制造过程不受季节或地理限制，并能获得适合制药应用的稳定、抗污染产量。值得注意的是，植物的自维持生长特性使其特别适合在资源有限或非常规环境（包括太空环境）中进行生物制造。
综上所述，这些特性突显了植物分子农业作为一种多功能、可持续生产系统的更广泛潜力。当与新兴的非变性纯化策略（如NPN辅助的抗原回收）相结合时，植物基平台可能为治疗性抗体开发提供一条生产高质量、构象完整抗原的稳健途径。
