《PLOS One》：A novel mRNA-based multiepitope vaccine candidate against Cryptosporidium hominis and Cryptosporidium parvum employing reverse-vaccinology and immunoinformatics approaches
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本研究运用反向疫苗学（RV）与免疫信息学方法，成功设计出一种靶向人隐孢子虫（C. hominis）与牛隐孢子虫（C. parvum）的新型mRNA多表位候选疫苗。该研究针对5种关键致病蛋白（氨肽酶、热休克蛋白、P23、丝氨酸蛋白酶、子孢子糖蛋白）的保守序列，筛选出最优CD8+、CD4+及连续B细胞表位，构建了具有优异结构稳定性、抗原性、受体结合亲和力（与TLR-2/TLR-4结合能低）及预期免疫应答（模拟显示可激活多种免疫细胞与抗体）的疫苗结构。尽管仅为计算机模拟结果，但为尚无FDA批准疫苗的隐孢子虫病（cryptosporidiosis）防治提供了一种创新思路，具有重要的潜在应用价值。
1. 引言
隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是一种由隐孢子虫（Cryptosporidiumspp.）引起的人畜共患、机会性肠道寄生虫病，主要通过粪-口途径传播。在众多虫种中，人隐孢子虫（C. hominis）和牛隐孢子虫（C. parvum）是感染人类的主要病原体。该病是导致人类和动物腹泻的重要原因，可占腹泻病例的20%，对免疫功能低下者（如艾滋病患者）威胁尤为严重，全球高达24%的艾滋病合并腹泻患者受其影响。其基因组高度相似，差异仅3-5%。隐孢子虫生活周期简单，仅需单一宿主，涉及孢子生殖、裂殖生殖、配子生殖和成囊等多个阶段，感染剂量可低至10个卵囊。虫体通过粘蛋白样糖蛋白和血小板反应蛋白相关粘附蛋白等介导对宿主肠上皮细胞的吸附，进而入侵并引起病理变化。目前，尚无FDA批准的隐孢子虫病疫苗，治疗药物（如硝唑尼特）效果有限，尤其在免疫缺陷患者中。因此，开发有效疫苗迫在眉睫。随着mRNA疫苗技术在抗击SARS-CoV-2中的成功应用以及反向疫苗学（RV）、免疫信息学的发展，使得无需实验室培养病原体即可通过计算机模拟快速设计候选疫苗成为可能。本研究旨在利用这些先进方法，开发一种针对C. hominis和C. parvum的新型mRNA多表位疫苗。
2. 材料与方法
研究遵循一套系统的in-silico（计算机模拟）流程。首先，从NCBI数据库获取C. hominis和C. parvum的5种关键致病蛋白（氨肽酶、热休克蛋白、P23蛋白、丝氨酸蛋白酶、子孢子糖蛋白）的氨基酸序列，通过多序列比对生成各自的保守序列。接着，使用免疫表位数据库（IEDB）预测这些保守序列的CD8+T细胞（MHC-I）和CD4+T细胞（MHC-II）结合表位，同时使用ABCpred服务器预测连续B细胞表位。筛选标准包括百分位排名（≤1.00）、抗原性（阈值>0.4）、非过敏性及非毒性。利用IEDB的人群覆盖率分析工具评估所选T细胞表位在全球主要人群区域的覆盖情况。然后，将筛选出的最佳表位与佐剂（50S核糖体蛋白L7/L12）通过特定连接子（EAAAK、AYY、AK、KFER）连接，构建出多表位疫苗序列。随后，对疫苗蛋白进行了一系列生物信息学分析与验证：使用Expasy ProtParam分析其生物物理特性（如分子量、等电点pI、不稳定指数、脂肪族指数、平均亲水性GRAVY等）；通过AlgPred、AllerTOP v.2.0等工具评估过敏性；通过VaxiJen 2.0和ANTIGENpro评估抗原性。使用PSIPRED、GOR4和SOPMA服务器预测疫苗的二级结构。利用I-TASSER服务器进行三级结构建模，并通过GalaxyWEB服务器优化，最后用SAVES v6.0（用于Ramachandran图和ERRAT评分）和ProSA服务器（用于Z评分）验证模型质量。使用Ellipro服务器预测不连续B细胞表位。分子对接方面，使用ClusPro 2.0服务器将疫苗模型与人Toll样受体TLR-2（PDB: 2Z7X）和TLR-4（PDB: 3FXI）进行对接，分析结合能和相互作用（盐桥、氢键等）。通过MM-GBSA（分子力学广义波恩表面积）方法计算结合自由能。利用iMODS服务器对疫苗-TLR-2和疫苗-TLR-4复合物进行分子动力学模拟，分析其协方差、弹性网络、B因子、可变形性、特征值和方差以评估复合物稳定性。为评估表达可行性，使用Java Codon Adaptation工具对疫苗DNA序列进行密码子优化（针对大肠杆菌K12表达），计算GC含量和密码子适应指数（CAI），并使用SnapGene软件将其克隆到pET-28a(+)载体中。利用C-ImmSim服务器进行免疫反应模拟，预测疫苗三次注射后（时间间隔模拟为0, 28, 56天）B细胞、T细胞（辅助T细胞TH、细胞毒性T细胞TC、调节性T细胞TR）、自然杀伤细胞（NK）、树突状细胞（DC）、巨噬细胞（MA）的动态变化以及抗体（IgM、IgG）和细胞因子（如IFN-γ、IL-2）的水平。最后，将疫苗序列转录为mRNA，并使用RNAfold服务器预测其二级结构和最小自由能（MFE），以评估mRNA稳定性。
3. 结果
3.1. 序列获取与比对及表位预测
成功获得了两种寄生虫五种蛋白的序列并生成了保守序列。预测并筛选出10个最佳的9肽CD8+T细胞表位、10个最佳的15肽CD4+T细胞表位以及10个最佳的连续B细胞表位，它们均具有良好的抗原性、非过敏性和非毒性。
3.2. 人群覆盖率分析
疫苗表位对全球主要地区（南北美洲、大洋洲、欧洲、亚洲、非洲大部分地区）的合并等位基因（MHC-I和MHC-II）人群覆盖率预计达到100%，全球总覆盖率分别为MHC-I等位基因98.55%、MHC-II等位基因99.99%，显示出广泛的潜在保护范围。
3.3. 疫苗构建
将筛选出的表位与佐剂通过特定连接子串联，构建了最终的多表位疫苗序列。
3.4. 疫苗生物物理特性验证
疫苗蛋白分子量为57570.04 Da，由523个氨基酸组成。其等电点pI为5.34，平均亲水性指数GRAVY为-0.829，表明其为亲水性蛋白。不稳定指数为38（小于40），提示其在体内稳定。脂肪族指数为53.17。多种工具预测证实该疫苗候选物具有抗原性且无致敏性。
3.5. 疫苗结构建模与验证
二级结构预测显示疫苗含有较高比例的α螺旋（GOR4: 43.02%； SOPMA: 37.67%）和无规则卷曲，以及一定比例的β折叠。三级结构模型经过优化和验证，Ramachandran图显示83.1%的残基位于最优区，Z评分为-7.39，ERRAT评分为82.328，表明模型质量良好。此外，预测出259个不连续B细胞表位。
3.6. 分子对接、结合自由能与动力学模拟
分子对接显示疫苗与TLR-2和TLR-4均有强烈的相互作用，最低结合能分别为-1151.9和-1028.3。MM-GBSA计算的总结合自由能分别为-63.3 kcal/mol（疫苗-TLR-2）和-70.17 kcal/mol（疫苗-TLR-4），表明结合稳定。分子动力学模拟分析（协方差图、弹性网络、B因子、可变形性、特征值、方差）进一步证实了两种复合物在生理条件下的结构稳定性和柔性。
3.7. 密码子优化与克隆
密码子优化后，疫苗序列的GC含量为47.02%，密码子适应指数CAI为0.9664，预示其在大肠杆菌表达系统中可能具有高效表达潜力。成功在in-silico中将其克隆至pET-28a(+)载体。
3.8. 免疫反应模拟
C-ImmSim模拟显示，接种三剂疫苗后，可诱导强烈的特异性免疫应答：B细胞数量显著增加并长期保持活性；辅助性T细胞（TH）和细胞毒性T细胞（TC）活性增强并持续近一年；记忆B细胞和T细胞持续存在；抗体（IgM和IgG）水平持续上升；并激活了IFN-γ和IL-2等关键细胞因子。
3.9. mRNA结构稳定性
预测的疫苗mRNA二级结构的最小自由能（MFE）为-388.70 kcal/mol（最优结构）和-250.50 kcal/mol（中心结构），表明其具有较好的热力学稳定性，有利于在宿主体内的递送、转录和表达。
4. 讨论
本研究利用反向疫苗学和免疫信息学，成功设计出一种靶向C. hominis和C. parvum五种关键蛋白保守表位的新型mRNA疫苗候选物。与既往类似研究相比，本研究靶向蛋白数量较多且针对两种主要致病虫种，具有一定新颖性。疫苗设计涵盖了可激活细胞免疫（CD8+和CD4+T细胞）和体液免疫（B细胞表位）的多重表位，并显示出极高的全球人群覆盖率。生物物理分析和结构模型验证表明该候选疫苗具有亲水性、稳定性、良好的抗原性和无致敏性。与先天免疫关键受体TLR-2和TLR-4的强效对接及后续的MM-GBSA、分子动力学模拟分析，从能量和构象动力学的角度证实了其相互作用的稳定性与强度，这是疫苗发挥免疫刺激作用的重要基础。密码子优化和克隆模拟为后续的体外表达实验奠定了基础。免疫模拟结果令人鼓舞，预测疫苗能激发广泛而持久的适应性免疫应答，包括T细胞、B细胞的活化、增殖与记忆形成，以及抗体和细胞因子的产生。mRNA结构的稳定性预测为其实际应用提供了又一支持。然而，本研究完全是计算机模拟预测，存在固有局限性，如缺乏长期免疫力预测、结构预测可能存在误差、未考虑佐剂相互作用的复杂性、未经验证的蛋白稳定性、潜在的意外过敏原性或毒性等。因此，该候选疫苗的有效性、安全性和长期保护效果必须通过后续的临床前实验（体外和动物模型）以及严格的临床试验来进一步验证。
5. 结论
本研究通过整合反向疫苗学、免疫信息学和结构生物信息学工具，设计出一种针对人隐孢子虫和牛隐孢子虫的新型mRNA多表位候选疫苗。In-silico分析表明，该疫苗候选物具有良好的生物物理特性、结构稳定性、与TLR-2/TLR-4的高亲和力、广泛的人群覆盖率以及激发强效且持久的细胞与体液免疫应答的潜力。这些结果为开发首个用于防治隐孢子虫病的mRNA疫苗提供了重要的理论依据和设计蓝图。尽管结果充满希望，但必须认识到这仅是研发的第一步，未来的实验验证对于将这一计算模型转化为实际可用的疫苗至关重要。
