引言
中风是全球范围内导致死亡的第二大原因。缺血性中风会诱导活性氧（ROS）产生，从而触发一系列炎症因子级联反应，最终导致炎症反应。先前研究表明，维持最佳水平的铜离子可有效减轻与中风损伤相关的组织损伤和炎症。铜是大脑中众多生理过程必需的微量元素。恢复大脑铜平衡已被证明可在多种动物疾病模型中防止慢性神经退行性变。例如，以铜缺乏为特征的孟克斯病（Menkes disease）会导致进行性神经功能恶化，通常在3岁前死亡。
铜缺乏也与缺血性中风有关。缺血状态会减少线粒体ATP的产生，从而损害铜的递送。铜不足会降低血管弹性，增加缺血事件的风险。相反，增加铜摄入量与中风风险降低相关。这些发现凸显了开发有效的铜递送系统以治疗铜缺乏相关疾病的迫切需求。
目前已开发出几种补充铜的策略，例如，亲水性铜复合物（如铜-组氨酸）可通过肠胃外给药来恢复铜水平和酶活性。然而，它们对神经病理的治疗效果有限，主要原因是脑渗透性差。铜(II) 二乙酰基-双(4-甲基-3-缩氨基硫脲)（Cu(II)-ATSM）具有在缺氧条件下释放外源性结合的铜，并能从循环中快速清除（半衰期22.4分钟）的能力。Cu(II)-ATSM具有增加的血脑屏障（BBB）渗透性和跨越BBB的能力。因此，64Cu-ATSM能增强BBB的穿透。阿尔茨海默病小鼠模型被用来测试64Cu-ATSM的效果，该物质可穿过BBB并递送至下丘脑。64Cu-ATSM在PET成像中的应用使得获取有关肿瘤氧合（缺氧）的宝贵临床数据成为可能，从而有助于更准确地预测实体瘤患者的治疗反应和生存时间。同时，64Cu-ATSM在日本已完全被用作一种治疗诊断剂。尽管64Cu-ATSM作为一种放射治疗诊断剂显示出潜力，但目前仍在研究新的铜基化合物以增强诊断能力，特别是在涉及铜代谢异常的情况下。
埃列克沙莫（Elesclomol， ES）最初是作为转移性黑色素瘤的化疗药物开发的，最近因其铜转运能力而受到关注。ES与细胞外Cu(II)离子形成复合物（Cu(II)-ES），该复合物在线粒体内被还原为Cu(I)，在此过程中产生ROS。这种机制使ES成为缺氧条件下潜在的铜递送载体。将ES与64Cu偶联，类似于ATSM，为通过PET无创成像铜转运提供了独特的机会。
在本研究中，我们探究了ES是否能够有效地将铜递送至缺血脑组织。我们使用64Cu作为替代示踪剂，通过PET成像可视化铜的转运过程。将ES用64Cu放射性标记后，我们通过PET成像和离体生物分布分析评估了64Cu-ES在正常C57BL/6J小鼠中的药代动力学。此外，在正常和缺血性斯普拉格-道利（Sprague–Dawley， SD）大鼠中进行了PET成像，以评估64Cu-ES在脑组织中的可及性和特异性。
材料与方法
64Cu-ES和64Cu-ATSM的放射性合成
ES和ATSM分别购自TargetMol和ABX Advanced Biochemical Compounds。放射性标记程序按照先前报道的方案进行。64Cu通过HM-10HC+回旋加速器生产，通过轰击64Ni并用1 mol/L超纯盐酸洗脱收集64CuCl2。将20 μg的ES或ATSM溶解在20 μL DMSO和80 μL醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L， pH = 4.1）中。然后将该溶液与100 μL的64CuCl2溶液（在醋酸-醋酸钠缓冲液中为1 mCi， 0.1 mol/L， pH = 4.1）混合。放射性标记反应在80°C下进行10分钟。使用Sep-Pak C18固相萃取柱纯化标记的复合物（64Cu-ES和64Cu-ATSM）。通过放射性反相HPLC（岛津，日本京都）分析配体和复合物的纯度以及复合物的放射化学纯度。
血清稳定性测定
将64Cu-ES或64Cu-ATSM与小鼠血清在37°C温和振荡下孵育1、2和4小时。使用配备C18柱的radio-HPLC仪器分析样品以评估体外稳定性。根据HPLC保留时间和放射化学纯度确定稳定性曲线。
动物
所有动物实验均获得中国医学科学院北京协和医学院药物研究所动物伦理委员会批准。本研究使用C57BL/6J小鼠和SD大鼠。所有程序均按照机构动物护理和使用委员会的指南进行。
脂溶性测量
通过将64Cu-ES或64Cu-ATSM在正辛醇和磷酸盐缓冲液（PBS， 0.1 mol/L， pH 7.4）之间分配来评估脂溶性。将等体积的化合物和每种溶剂在试管中混合，充分涡旋，并在室温下以4000 rpm离心5分钟。小心分离上层（正辛醇）和下层（PBS）相并称重。使用伽马计数器测量各层的放射性。Log P值计算为 log[cpm/g(正辛醇)]/[cpm/g(PBS)]。
缺血模型建立
根据先前发表的方案建立缺血模型。采用血管内线栓法阻断大脑中动脉30分钟诱导短暂性局灶性缺血。简而言之，用4%异氟醚麻醉SD大鼠，并用1.8%异氟醚维持麻醉。将涂有硅胶的4-0单丝尼龙线通过颈内动脉插入至大脑中动脉分叉处（约16–18 mm）。用丝线缝合切口。在闭塞30分钟并从麻醉中恢复后，再次麻醉大鼠，并撤出线栓以允许再灌注。在整个过程中仔细监测并维持体温在生理范围内。
正常及缺血模型中的PET/CT成像
对于正常C57BL/6J小鼠，通过尾静脉注射给予每只小鼠3.7 MBq的64Cu-ES或64Cu-ATSM。在注射后（p.i.）60分钟内进行动态PET/CT扫描。对于64Cu-ES，在注射后0.5、5、15、30、45和60分钟采集图像；对于64Cu-ATSM，在注射后0.5、1.5、2.5、5、45和60分钟采集图像。
在正常和缺血SD大鼠中，静脉注射每只大鼠37 MBq的64Cu-ES。在注射后1、4、20和24小时进行PET成像，以评估示踪剂在缺血组织中的分布和滞留情况。
离体生物分布
正常C57BL/6J小鼠通过静脉注射接受每只小鼠1.85 MBq的64Cu-ES或64Cu-ATSM。在异氟醚麻醉下，于注射后5、30、60和120分钟处死小鼠。取出主要器官（包括脑、心、肺、肝和肾）并称重。使用伽马计数器测量每个器官的放射性。计算每克组织注射剂量的百分比（%ID/g），并校正衰变。
统计分析
本研究主要采用描述性统计分析。数据表示为平均值±标准差，源自至少三次独立实验。使用GraphPad Prism 10软件通过未配对的Student t检验进行统计学比较。P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
在本研究中，使用64Cu作为替代物来可视化埃列克沙莫将铜离子转运至大脑的过程。选择64Cu-ATSM作为对照，因为它是成熟的缺氧放射治疗诊断剂，并且与ES具有相似的化学结构。64Cu-ES和64Cu-ATSM的放射性标记均获得了高放射化学纯度、产率和稳定性。脂溶性分析显示64Cu-ES的Log P值为1.38，而64Cu-ATSM为-0.24。在制剂后长达4小时内，未观察到任一化合物在小鼠血清中发生分解，证实了它们的血清稳定性。
64Cu-ES and 64Cu-ATSM. (A) Chemical structures of 64Cu-ES and 64Cu-ATSM. (B) Radiosynthesis of 64Cu-ES and 64Cu-ATSM. (C) Lipophilicity evaluations showing Log Pvalues of 64Cu-ES and 64Cu-ATSM. Stability analysis of (D) 64Cu-ES and (E) 64Cu-ATSM in mouse serum.">
进行动态PET/CT成像研究以评估药代动力学特征。将64Cu-ES和64Cu-ATSM静脉注射至正常C57BL/6J小鼠体内，并比较它们的脑摄取。PET/CT成像揭示了64Cu-ES和64Cu-ATSM在小鼠脑内的动态摄取模式存在显著差异。对于64Cu-ES，摄取显示出明显的时间依赖性增加，在注射后0.5分钟时略低，随后稳步上升。值得注意的是，从注射后5分钟开始，64Cu-ES在整个大脑中显示出强烈的摄取，表明其能有效穿透血脑屏障。相比之下，64Cu-ATSM在0.5分钟时迅速在全脑累积，但在2.5分钟后迅速下降，在5分钟时主要定位在前脑区域，并在1小时后几乎消失。
64Cu-ES and 64Cu-ATSM. (A) PET/CT images of 64Cu-ES and 64Cu-ATSM in C57BL/6J mice. (B) Dynamic PET quantification of brain uptake within 1 h.">
对1小时内动态PET扫描的兴趣区域（ROI）摄取进行定量分析证实了这些差异。64Cu-ES和64Cu-ATSM在脑、心、肝、肺和肾在不同时间点的摄取显示在补充材料中。肝脏的摄取保持相对恒定，而在心脏和肺部观察到显著差异：与64Cu-ATSM相比，64Cu-ES在心脏和肺部的放射性分别高出2.5倍和10倍。脑摄取趋势与PET/CT结果一致，64Cu-ES的摄取在1小时内从4.83 %ID/cc增加到7.63 %ID/cc，而64Cu-ATSM则从8.54 %ID/cc下降到1.63 %ID/cc。
离体生物分布进一步凸显了两种化合物之间的差异。两种示踪剂均在肝脏、肺部和肾脏观察到高放射性积聚。然而，64Cu-ES在心脏的摄取明显更高。最显著的差异出现在大脑中。虽然64Cu-ATSM显示出相对较高的早期摄取（约3.55 %ID/g），但在注射后2小时时下降至1.10 %ID/g。相反，64Cu-ES的摄取在同一时期从1.80 %ID/g上升到4.23 %ID/g，这与PET发现一致。与64Cu-ATSM相比，64Cu-ES在脑内滞留时间延长可能归因于其更高的脂溶性。其他器官的摄取两者相似。
基于其优于ATSM的滞留能力，我们选择ES作为向脑内递送铜的候选物。正常SD大鼠中的PET研究证实64Cu-ES可以跨越血脑屏障，因为清晰检测到了放射性信号。在正常SD大鼠中评估了64Cu-ES在脑区的分布。注射后9天获得的平均PET图像显示其在大脑中广泛摄取，特别是在中脑和前脑，包括大脑皮层、纹状体和海马等区域。
对1小时内动态PET扫描的ROI摄取进行定量分析显示，扣带皮层的摄取最高，其次是纹状体、大脑皮层、海马、丘脑和脑桥。小脑和杏仁核的摄取最低。值得注意的是，缺血性中风会导致纹状体、大脑皮层和海马损伤，通常导致药物摄取相对较高。因此，这些区域由于高能量需求、密集的线粒体含量和高NADH水平，便于将Cu(II)还原为Cu(I)并促进滞留，常被用于缺血和缺氧的研究。
为了研究64Cu-ES对缺血区域的可及性和特异性，在大脑中动脉闭塞（MCAO）SD大鼠（一种广泛使用的缺血性中风模型）中进行了PET成像。代表性PET图像展示了64Cu-ES在不同时间点在缺血大脑中的分布，证实了其脑摄取。定量PET分析显示，在注射后24小时内，缺血侧和非缺血侧的摄取是均匀的。在最初一小时的动态扫描中也观察到类似的模式。
我们还评估了64Cu-ES在纹状体、大脑皮层和海马的区域摄取。PET成像显示缺血半球和非缺血半球之间没有显著差异，时间-放射性曲线在所有三个区域都显示出一致的趋势，反映了全脑行为。
讨论
线粒体中铜代谢障碍是与线粒体能量功能障碍相关的最常见先天异常之一。迄今为止，尚无有效的治疗方法。先前为治疗目的而直接补充铜的尝试均未成功，这可能与系统铜稳态的严格调控特性有关。这凸显了对改进的铜递送载体进行开发的迫切需求。
缺血性中风以脑血流中断为特征，仍然是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因。脑缺血诱导的缺氧条件会破坏线粒体功能，从而损害大脑中的铜代谢。早期研究表明，Cu(II)-ATSM可以减少缺血性中风小鼠模型的病变体积并改善神经功能结果。ES与ATSM具有相似的核心结构，已在多项临床试验中进行了评估，并显示出良好的毒性特征。然而，缺乏直接证据证实ES可以递送至缺血病灶。
在本研究中，我们使用了正电子发射放射性核素64Cu，其半衰期为12.7小时，适用于诊断性PET成像和治疗诊断应用。我们用64Cu对ES和ATSM进行了放射性标记，并全面表征了放射化学性质。在结构上，ES与ATSM的不同之处在于用苯环取代了甲基。ES是一种具有双（硫代酰肼）酰胺结构的化合物。它能以1:1的比例结合铜。具有更长链的ES比ATSM具有更大的分子量和更紧凑、更刚性的分子构象。值得注意的是，ES对铜(II)离子表现出极高的亲和力，其结合亲和力值为1024mol/L。ES通过四个孤对电子的捐赠与Cu (II)离子形成稳定的复合物。这使得结构更具疏水性，从而增加了疏水性并增强了BBB的穿透能力。铜-ES复合物具有更大的分子回转半径和更复杂的构象。Cu(II)和ES之间形成了强键，预计Cu(II)从复合物中解离缓慢，这显著延迟了在脑组织内的释放并阻碍了清除，导致滞留时间延长。值得注意的是，PET成像显示两种示踪剂的分布模式不同：64Cu-ATSM主要集中在前脑区域，而64Cu-ES随着时间的推移在整个大脑中显示出更弥散的摄取。这些数据与先前的报告相符。此外，这些发现与先前认为64Cu-ATSM在血液中迅速解离并仅通过铜代谢途径被摄取的假设形成对比。相反，我们的数据表明配体结构本身在药代动力学中起着重要的功能作用。
从机制上讲，在进入细胞后，Cu(II)-ES进入线粒体，随后在还原为铜(I)后释放铜，该反应很可能由线粒体铁氧还蛋白1介导。释放到线粒体中的铜(I)可以与分子氧发生反应，产生ROS。这些分子过量可导致无法控制的氧化应激，并最终通过凋亡导致癌细胞死亡。新出现的证据表明，ES的作用也可以通过一种新的细胞程序性死亡模式来解释，即铜死亡（cuproptosis），它是由铜介导的细胞毒性应激引发的，这种应激源于铜与三羧酸循环中硫辛酰化酶的直接结合。尽管64Cu-ES和64Cu-ATSM具有相似的细胞摄取机制，但在离体生物分布中观察到的差异很可能源于它们不同的化学性质。ES增加的脂溶性增强了组织渗透性并有助于延长滞留。相反，ATSM从脑组织中的快速清除可能限制了其在缺血条件下的应用。
铜是许多关键神经功能所必需的微量元素。ES和ATSM都能形成稳定的、脂溶性的、电中性的Cu(II)复合物，可以有效穿过细胞膜和血脑屏障。Cu(II)-ATSM已被广泛报道为治疗中风和其他急性脑损伤的有前途的治疗剂。然而，在我们的研究中，64Cu-ES在脑组织中显示出明显更长的滞留时间。因此，我们评估了其作为ATSM替代品在缺血性疾病中递送铜的潜力。
我们的PET成像数据证实，注射64Cu-ES后，示踪剂有效地递送至大脑的两个半球，包括缺血区域。在缺血损伤的早期阶段，受影响半球的64Cu-ES摄取与对侧（非缺血）侧相当。这一观察结果表明，ES成功恢复了缺血区域的铜水平，支持了其作为中风治疗铜递送载体的潜力。
然而，这项工作存在一些局限性。一方面，我们证明了ES可能是一种潜在的中风协同递送载体，然而缺乏功能性结果的验证，特别是Cu-ES在治疗缺血性中风中的结果和机制，包括神经保护、减小梗死面积和行为恢复。这将有力地支持ES介导的铜递送在中风模型中的作用。这部分内容的缺失是本手稿的一个局限性，我们将建议将其作为未来研究的方向。另一方面，尽管ES在缺血性中风大鼠模型中显示出对铜递送的一些效果，但其转化应用于人类患者仍然面临一系列根本性挑战。这些挑战主要源于物种间深刻的生理和病理生理差异，特别是铜代谢、BBB特性以及潜在毒性的差异。
首先，不同物种之间在铜代谢和稳态方面存在差异。人体拥有更为复杂和精细的铜稳态系统。铜吸收、转运、储存或排泄任何阶段的差异都可能导致ES-Cu在人体内的半衰期、组织分布和生物利用度与动物模型相比存在显著不同。脑缺血会引发全身应激反应，包括微量元素代谢的紊乱。动物模型无法完全复制人类患者的复杂性，特别是那些患有多重合并症的患者。这些因素显著改变了铜代谢，增加了治疗的不确定性和风险。其次，血脑屏障是决定ES-Cu能否有效到达病变部位的关键因素，其物种差异是转化过程中的主要障碍。常用啮齿动物模型的BBB与人类相比在结构和功能上存在差异。在实验性脑缺血模型中（通常通过机械或药理学方法诱导），BBB破坏的程度、时间和模式可能与实际人类缺血性中风中所观察到的不同。这种差异可能导致对ES-Cu跨越BBB的转运效率的过高或过低估计。第三，短期动物研究可能无法充分揭示ES-Cu的长期毒性，例如慢性器官积累（特别是在肝脏、肾脏和角膜）或对认知功能的潜在影响。鉴于实验室动物的寿命较短，某些延迟的神经毒性可能未被发现。ES-Cu可能诱发溶血、肝毒性、肾毒性等不良反应。这些人类器官对毒性的敏感性与啮齿动物不同，使得从动物数据外推的最大耐受剂量对人类可能不准确。
此外，通过先进的光谱技术识别大脑中的铜物种是阐明Cu-ES作用机制的关键一步，这将成为我们未来研究的核心重点之一。
结论
在本研究中，我们探究了ES作为一种铜递送剂将铜转运至大脑的能力。用64Cu进行放射性标记后，我们成功合成了64Cu-ES和64Cu-ATSM。体内和离体研究均证明，与64Cu-ATSM相比，64Cu-ES在大脑中表现出更长的滞留时间。PET成像证实，ES能够将铜递送至中风SD模型大鼠的缺血大脑中，并且这种递送不受缺血损伤的影响。这些发现支持了ES作为缺血性中风治疗策略的潜力。
