色氨酸酶的挖掘与表征：指向吲哚衍生物生物合成的工业应用

《ACS Omega》：Tryptophanase Mining and Characterization toward the Biological Production of Indole Derivatives

本研究聚焦于色氨酸酶的挖掘、功能表征与工业应用。通过机器学习驱动的变异自编码器（VAE）可视化序列空间，筛选并鉴定了一个包含21种酶、涵盖细菌、古菌和真核来源的多样性色氨酸酶（TRPase/TIL）面板。研究团队对其中18种可溶性表达的酶进行了全面的生化表征，测定了其最适反应条件、热稳定性（Tmapp）及动力学参数（KM， kcat），揭示了其在不同pH、温度下的活性差异。该工作成功鉴定了具有高周转数（7.03 s-1， AsoTIL）及优良操作稳定性的酶。最后，研究以生物基靛蓝合成为案例，将最优的PreTIL与黄素单加氧酶（FMO）、甲酸脱氢酶（FDH）耦联，通过实验设计（Design of Experiments）优化，实现了3.0 ± 0.8 mM的靛蓝原位产量，并分析了该多酶级联反应的瓶颈，为基于可再生原料的化学品生物制造提供了适配性广泛的酶工具箱与重要见解。

　　

酶发现与面板设计

为探究色氨酸酶（TRPase/TIL）的功能多样性，研究旨在设计一个既最大化系统发育广度又保持紧凑（约20个序列）的酶面板，以适配其低通量的分析方法。首先，研究者使用来自霍乱弧菌的VchTIL作为查询序列，通过EnzymeMiner工具对公共数据库进行挖掘，并仅将PLP结合赖氨酸K271指定为必需残基。经过自动化挖掘、去重和基于序列多样性（与查询序列>80%相似性）及长度（400-600个氨基酸）的筛选，初步获得了422个细菌、13个真核和2个古菌序列。在进一步基于预测溶解度（SoluProt得分）和最高系统发育多样性的过滤后，最终选定了一个初始面板，包含8个细菌、5个真核和2个古菌序列。随后，该面板被补充了先前已表征过的来自大肠杆菌和霍乱弧菌的酶（EcoTIL， VchTIL），以及其他已知在高性能体内吲哚生产中表现优异的酶（MinTIL， PreTIL）。最终得到的19个序列面板中，有14个是全新的。所有新序列都生成了具有预期折叠的高置信度AlphaFold2模型，表明它们很可能是色氨酸酶。该面板的平均成对序列相似性为42.3 ± 9.7%。

为确保这个精心挑选的面板能充分代表天然色氨酸酶的序列多样性，研究采用了基于机器学习的方法——变异自编码器（VAE）——来可视化序列空间。VAE在色氨酸酶同源序列的多重序列比对（MSA）上进行训练，其潜在空间（latent space）能够捕获高阶序列模式，生成序列空间的“蒸馏”表示，从而实现清晰的蛋白序列可视化和聚类。与系统发育树和序列相似性网络等经典方法相比，VAE可视化避免了视觉上的杂乱，并为迭代扩展提供了稳定的坐标系统。在可视化潜在空间中，面板中的酶覆盖了大部分密集的序列簇。有趣的是，来自同一界的序列并不总是聚集在一起，这表明色氨酸酶的多样性不仅受系统发育模式影响，还可能受到功能结构约束（如保守的PLP结合位点、K⁺结合位点）以及水平基因转移（HGT）等进化过程的影响。

在收集了初步表征数据后，研究者将信息与可视化的潜在空间整合，以确定值得进一步探索的兴趣区域。在潜在空间的左侧，发现了表达失败或活性较差的酶；而活性最高的5个序列都位于右侧。这一观察结果促使研究者在潜在空间右侧选择两个簇，以更好地覆盖这个看似高活性的区域。从这两个区域中，分别选出33和34个序列，通过SoluProt和NetSolP工具的溶解度得分进行计算机评估，最终将两个额外的细菌序列（AsoTIL和CbaTIL）添加到面板中。AsoTIL成功表达并纯化，而CbaTIL未观察到可溶性表达。

色氨酸酶表征

面板中19个序列有17个在大肠杆菌中实现了可溶性表达，其中TarTIL， EinTIL， TtiTIL和LfiTIL部分存在于可溶部分，并与另外14个可溶性候选酶一起被成功纯化。通过差示扫描荧光法（DSF）测定了纯化酶的表观熔解温度（T_m^app），观测值范围很广，从45.4°C（FveTIL）到71.7°C（PvuTIL）。大多数细菌来源的序列具有较高的熔解温度，有几个超过70°C。尽管TarTIL来源于嗜热古菌，其熔解温度并不算最高（60.1°C）。

在确认所有纯化酶均具有色氨酸酶活性后，在pH 5.5至8.9的磷酸钾缓冲液范围内评估了每种酶的最适pH。总体而言，中性至碱性pH是TRPase的最适条件，在pH 7以上可观察到活性平台。此外，大多数TRPase在弱酸性pH下仍保持中等活性；然而，在pH 6以下活性急剧下降，MinTIL除外，它在pH 5.5时仍保持50%的活性。这些观察结果反映了PLP依赖性酶的pH敏感性，其最适pH通常在7.0至8.5之间。催化β-消除反应的PLP酶需要精确的质子转移，这强烈受pH影响。活性位点内的pH微环境可以促进反应，这解释了为何MinTIL在pH 5.5时仍有50%活性，而其他所有TRPase的残留活性均低于20%。

通过在30-55°C（或对在较低温度范围内未观察到最适温度的部分TRPase，在50-70°C）的温度范围内，在pH 7条件下测量4小时后的吲哚相对生成量，确定了最适温度。观测到的TRPase最适催化活性通常在45至55°C之间。此外，在已确定的最适条件下以及在30°C， pH 7的标准条件下，测定了所有功能性表达的TRPase的相对活性。细菌来源的TRPase明显比古菌和真核来源的TRPase更活跃，其中EarTIL和TclTIL分别是古菌和真核序列中最活跃的。在挖掘的TRPase中，只有TtiTIL的活性与先前已表征的四个TRPase（PvuTIL， PreTIL， VchTIL和EcoTIL）相当。

随后，AsoTIL经历了相同的生化表征流程；观察到了类似的pH曲线和高达65°C的特殊最适反应温度，其T_m^app为71.0°C。

在最适条件和标准条件下，测定了6个最活跃变体的表观转换数（k_cat^app）和K_M值。尽管在10分钟内的活性表明这些酶具有可比性，但初始动力学揭示它们差异显著，在最适条件下k_cat^app值在1.58至7.03 s^-1之间。对于所有TRPase，当反应温度升高到确定的最适温度时，K_M会降低，其中VchTIL降低了近5倍。此外，除了PvuTIL和AsoTIL分别提高了2倍和3.5倍外，非优化与优化条件之间的k_cat^app差异可忽略不计。对于AsoTIL，这个具有最高最适温度的TRPase，观察到了迄今为止报道的最高周转数，在65°C时k_cat^app为7.03 s^-1，突显了其工业潜力。有趣的是，k_cat^app值似乎随着与VAE潜在空间原点距离的增加而增加。由于VAE是在MSA上训练的，潜在空间的中心区域富含高概率的、类似共有序列的序列，而这类序列通常与较高的热稳定性相关，而高催化活性通常依赖于构象柔性。因此，观察到的趋势与广泛报道的酶稳定性与催化活性之间的权衡关系一致。

总之，在相对活性图中表现最活跃的六个TRPase具有不同的pH和温度最适值，形成了一个可适应不同应用条件的色氨酸酶集合：高pH最适（VchTIL）、高最适反应温度（AsoTIL）、在30°C时的高速率（VchTIL）、在30°C时的低K_M（EcoTIL）或适应酸性pH（MinTIL）。

靛蓝合成优化

研究者以靛蓝的酶法合成为案例，研究TRPase在多酶级联反应中的应用。首先确定了级联反应中另外两种酶——黄素单加氧酶（FMO）和甲酸脱氢酶（FDH）——的最适反应条件，随后从面板中确定了最合适的TRPase。两种酶均偏好碱性pH，最适pH分别为8.2和8.4。后续实验选择pH 8.2，因为据报道，MaFMO是两者中较慢的酶。类似地，在38-44°C温度范围内监测产物形成，两种酶的最适温度均为40°C，因此后续实验使用此温度。

通过将反应混合物在40°C下、不含底物L-色氨酸的条件下预孵育不同时间，评估了六种TRPase的操作稳定性。TtiTIL和EcoTIL逐渐失去活性，7小时后剩余约50%，而VchTIL在此期间失去了近90%的活性。相反，AsoTIL， PvuTIL和PreTIL似乎没有显著丧失活性，在24小时内保持完全活性。一项额外实验评估了这6种酶在20°C溶液中存放4天的稳定性。TRPase在20°C下更稳定，24小时后活性保留>50%，但TtiTIL除外，它在一夜之间损失了约80%的活性。使用一级衰减模型从40°C数据外推表明，在更高温度下失活更快。此外，PvuTIL， PreTIL和AsoTIL确实会随时间损失活性，前两者在4天后活性保留约60%，而AsoTIL保持其相对活性>75%。最后，在0至100 μM PLP范围内测定了三种操作稳定性酶的PLP依赖性。有趣的是，PreTIL和PvuTIL在仅补充20 μM PLP时表现出与在100 μM PLP时相当的催化活性。值得注意的是，在不补充PLP的情况下，PreTIL保留了其最大活性的约75%，而PvuTIL仅保留~50%。这些发现表明，PreTIL的PLP结合口袋对PLP具有比PvuTIL更高的亲和力。相反，对于AsoTIL，当补充PLP高达100 μM时观察到活性呈上升趋势。基于参数、稳定性和PLP依赖性的信息，PreTIL似乎最适合用于靛蓝生物合成的酶级联反应，并被用于优化完整级联。

通过实验设计确定了MaFMO， MvFDH， NADP⁺和甲酸钾的浓度。在确定的参数下，进行了色氨酸转化为靛蓝的时间过程实验。与化学靛蓝参考物的HPLC色谱图和UV-Vis光谱比较，确认了生物靛蓝的形成，证据包括匹配的保留时间、吸收光谱及其特征性的深蓝色和不溶性。3小时后观察到3.0 ± 0.8 mM的靛蓝效价，随后在8小时后下降至1.9 ± 0.1 mM。该酶系统在前三小时实现了0.262 g L^-1h^-1的时空产率（STY），但反应没有进一步进行，限制了整体转化效率。虽然该STY与报道的发酵生产率相似，但这反映了使用外源添加的酶，与细胞内生产不具直接可比性。色氨酸在前30分钟内被快速消耗，导致吲哚短暂积累。然而，色氨酸的消耗速度很快下降，在接下来的七个小时内，仅转化了10 mM色氨酸。当流入停滞时，吲哚积累得到解决，并在两小时内全部转化为靛蓝。此后，级联反应不再产生额外的靛蓝。研究者在另一个使用吲哚-3-甘油磷酸（IGP）作为底物的类似酶级联中观察到了类似的现象。在那里，IGP到吲哚的转化由吲哚-3-甘油磷酸裂解酶（IGL）催化，然后是来自Nitrincola lacisaponensis的FMO与MvFDH组合将其转化为靛蓝。与TRPase一样，这个IGL也是一种PLP依赖性裂解酶，研究者同样观察到了吲哚形成的停滞。这些结果表明，PreTIL不是这个级联中的限制因素。相反，研究者假设，PLP依赖性裂解酶与FMO的组合可能受到FMO催化反应过程中产生的活性氧物种（ROS）的影响，ROS可能干扰PLP反应循环。尽管形成了3 mM靛蓝，但只有约20%的消耗色氨酸被计算在内。剩余的80%可能转化为副产物，可能是由于FMO缺乏区域选择性或吲哚的过氧化分别导致2-氧化吲哚和靛红，以及它们的缩合产物如靛玉红和异靛蓝。研究者在早期工作中观察到了类似的摩尔产率，并探索了可能导致这些副产物形成的反应机制。

结论

在本研究中，研究者挖掘并生化表征了一个多样化的色氨酸酶面板，包括13种新酶。该酶面板的多样性体现在其pH最适值、热稳定性和温度最适性上。尽管这些酶的pH最适值主要与化学反应相关，但研究者鉴定出了MinTIL，它能适应正常范围之外的酶活性。此外，在检查相对活性时，细菌来源的序列通常显示出比古菌或真核来源更高的相对活性。基于数据的变分自编码器（VAE）潜在空间探索，确定了两个额外的区域，其中一个区域产生了AsoTIL，这是一种具有高反应温度最适值（65°C）和迄今报道的最高周转数（7.03 s^-1）的色氨酸酶。对于六个最活跃的TRPase，研究者观察到了最适条件的显著差异，产生了一个可适应不同反应条件（如pH和温度）的TRPase集合。这展示了VAE模型的实用性，不仅用于确保广泛的序列空间覆盖，还能在实验数据的指导下精确定位功能兴趣区域。最后，在靛蓝生物合成的案例中，PreTIL似乎是最有希望的候选者，因为它表现出高稳定性，并与级联中互补酶的最适pH和温度相容。尽管合成突然停止，与早期工作中观察到的类似，但仍实现了3.0 ± 0.8 mM的靛蓝效价。本文呈现的结果表明，单加氧酶的区域选择性是提高效价和最小化副产物形成的关键因素。此外，研究者的发现表明FMO与PLP依赖性酶之间可能存在不相容性，可能是由于ROS的产生。因此，未来的研究可能集中在通过工程化提高区域选择性，或探索酶级联中替代的氧化酶，如非特异性过氧合酶。这种替代方案可以通过消除昂贵的辅助因子及其回收机制来简化系统。