基于《Flow Cytometric Screening Reveals Nucleic Acid Dyes Aberrantly Stain Peptidoglycan Sacculi》一文标题和摘要，一个具有专业性和吸引力的中文标题可以是： 中文标题 流式细胞术筛选揭示核酸染料异常染色肽聚糖囊状体

《ACS Infectious Diseases》：Flow Cytometric Screening Reveals Nucleic Acid Dyes Aberrantly Stain Peptidoglycan Sacculi

本研究通过系统筛选商业核酸染料，不仅为革兰氏阴性菌和阳性菌的多色流式细胞术（Flow Cytometry）面板开发提供了关键试剂选择依据，更意外发现部分染料（如SYTO系列）能与纯化的肽聚糖（PG）结合。这一现象提示，在含细胞碎片的复杂样本（如微生物群）中，这些染料的脱靶结合可能影响其区分活细胞与非细胞碎片的能力。文章强调，选择特异性高、亮度强的绿色荧光染料（如SYTO 24）对于构建高密度多色微生物流式面板至关重要。

　　

流式细胞术是分析混合群体中单个细胞的有力工具，但用于微生物分析的荧光染料调色板相对有限。本文旨在通过系统筛选商业化的核酸染料，为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的多色流式细胞术（Flow Cytometry）面板开发提供参考。

固定细菌的核酸染料染色

研究人员首先展示了在低前向散射高度（FSC-H）阈值下，仅凭散射光难以将微生物细胞（如表达mNeonGreen的^{E. coli}）与背景数字噪音区分开来。因此，需要一种正交方法（如核酸染色）来识别不表达荧光蛋白的野生型细菌。为此，他们筛选了24种商品化核酸染料（包括22种细胞渗透性的SYTO染料，以及常用的SYBR Green I和7-AAD），对固定后的革兰氏阴性菌^{E. coli}（Eci）和革兰氏阳性菌^{E. faecalis}（Efs）进行染色评估。

结果显示，不同染料的染色效率差异巨大，可达三个数量级。一些染料对革兰氏阴性菌^Eci表现出强烈的染色偏好，例如常用的“活死”染色试剂SYTO 9对^Eci的染色强度比^Efs高近8.5倍。总体而言，SYTO染料对^Eci的染色效果优于^Efs，这可能与两者基因组大小（^Eci为4.6 Mb，^Efs为2.9 Mb）以及细胞壁厚度、组成和渗透性的差异有关。在测试的染料中，SYTO Orange染料组表现最差，而SYTO Green染料信号最强。特别是SYTO 24，其对两种测试微生物的亮度均超过了SYBR Green I（^Eci提高4.79倍，^Efs提高1.10倍）。染色指数计算进一步证实，绿色核酸染料，尤其是SYTO 24，能最好地区分阳性与阴性细胞群。此外，光谱分析表明，许多SYTO Orange和Red染料在多个激光激发通道下都有广泛的信号，这可能影响其在多色面板中的使用；而绿色荧光染料（如SYTO 24）则显示出高强度和有限的通道串扰，是理想的广谱核酸染料。

纯化肽聚糖囊状体的脱靶染色

在筛选过程中，研究人员意外发现某些染料能染色含有细胞壁肽聚糖（Peptidoglycan， PG）的颗粒物质。为了验证这些染料对完整细胞的特异性，他们使用纯化的PG囊状体进行了类似的染色实验。纯化过程包括了核酸酶消化步骤以去除污染的核酸。

令人惊讶的是，几乎所有SYTO染料都对PG表现出高于背景信号的染色水平。虽然大多数SYTO Green染料染色较弱，但商用“活死”试剂SYTO 9表现出中等的脱靶标记。相比之下，SYTO Red染料（如SYTO 60， 62， 64）的脱靶染色问题严重得多，其强度比SYBR Green I高出30倍以上。为确认观察到的PG染色不是由纯化后残留的核酸引起，研究人员用100倍标准量的核酸酶处理PG，染色谱基本保持不变，证实了染料的脱靶结合。某些染料在PG和完整细胞中的最强发射通道存在细微差异，这可能源于染料与PG相互作用导致的物理环境变化。荧光显微镜观察也支持了这一结论：SYTO 24（低脱靶染色）和SYTO 64（高脱靶染色）都能染色固定细胞，但只有SYTO 64能染色PG囊状体。

为了解染料与囊状体相互作用的性质，研究人员进行了延长洗涤实验。如预期那样，SYBR Green I和SYTO 24在多次洗涤后信号损失很小，表明它们与核酸是高亲和力结合。相反，红色染料SYTO 59表现出快速洗脱，提示其与细胞和PG的结合是微弱、非特异性的。而SYTO 64则在多次洗涤中保持稳定信号，且对PG囊状体的信号强度高于细胞。进一步的“洗脱”实验（染色、洗涤后于缓冲液中孵育）显示，绿色核酸染料信号如预期般因非共价结合染料的扩散而损失，但SYTO 64的染色在孵育期间持续存在。这表明SYTO 64对细胞和PG共有的某种结构特征具有高亲和力，其结合模式尚不明确。

为多色面板选择核酸染料

鉴于不同染料的荧光强度和潜在脱靶结合存在差异，研究旨在量化各染料对微生物的稳健染色能力及其区分细胞与环境碎片的能力。通过比较每种染料对细菌与相应PG囊状体的染色强度，研究人员发现SYTO Green染料通常比其他SYTO染料更具区分度。

除了使用未染色对照计算经典染色指数外，还通过比较靶向细胞染色与脱靶PG染色来评估“靶向”染色指数。结果与预期一致，SYTO Green染料表现出最高的靶向染色指数。对于^Eci的染色指数普遍优于^Efs，这可能源于^Efs细胞壁中PG含量更高，导致更强烈的脱靶结合。在所有样本中，SYTO 24的靶向染色指数均名列前茅。相比之下，SYTO Red探针几乎无法区分细胞与PG，SYTO 64等甚至显示出负染色指数，表明其脱靶染色强于靶向染色。

为具体展示不同性能染料的差异，研究使用表达荧光蛋白mNeonGreen或mScarlet3的^Eci进行了混合染色实验。将荧光蛋白阳性细胞与约4倍过量的纯化PG混合，然后用互补的核酸染料染色，观察能否区分细胞与碎片。

当使用性能不佳的染料（如靶向染色指数中等的SYTO 59或极差的SYTO 64）时，细胞与PG混合物在核酸染料通道中呈现为单一的、弥散的高阳性群体，无法区分彼此，仅有约20%的核酸染料阳性单细胞是真正的细胞。而当使用性能良好的染料（如SYBR Green I和SYTO 24）时，在核酸染料通道中可观察到更明显的不同群体，仅凭染料发射光即可很好地区分，且核酸染料阳性与荧光蛋白阳性群体基本吻合。这些数据共同表明，绿色核酸染料在分离细胞与碎片群体方面表现更佳。

总之，该研究表明当前用于微生物流式细胞术的核酸染料库仍然有限。尽管未涵盖所有商品化染料或染色条件，但结果表明绿色核酸染料在亮度和靶向活性方面通常表现最佳，其中某些不常用的SYTO染料（如SYTO 24）在信号强度上优于SYBR Green I。与SYTO Red染料相比，SYTO Green染料的脱靶结合要少得多，因此在设计用于可能含有大量碎片的样本的多色面板时应避免使用红色染料。未来，使用光谱流式细胞术分析这些染料的染色谱，可能揭示其发射模式的细微差异，为分析过程中的解混提供优势。研究结果也揭示了现有核酸染色工具库的潜在空白。开发具有窄发射光谱的明亮核酸染料（用于绿-黄和红色通道），甚至具有大斯托克斯位移的串联核酸靶向染料，将极大地扩展构建高密度多色面板的能力。这项工作不仅有助于为未来的微生物流式细胞术实验正确选择核酸染料，也有望启发开发新的、荧光正交的探针，以解析共生和致病微生物的代谢活动。