《ACS Sensors》：Colorimetric Sensing of MicroRNAs in Whole Blood for Early Diagnosis of Heart Failure
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本文介绍了一种名为CQmiR的创新性即时检测(POC)技术，它通过比色环介导等温扩增(LAMP)反应，在非临床环境下快速、定量检测全血中的MicroRNA(miRNA)，用于心力衰竭(HF)的早期诊断。该技术实现了单核苷酸特异性与亚飞摩尔(10-15M)级灵敏度，并通过小鼠模型验证了其利用9-miRNA特征谱预测心衰风险的潜力。
引言
心力衰竭(HF)以其高发病率、致残率和死亡率，成为65岁以上成年人最常见的住院原因。随着人口老龄化，越来越多的人面临心衰风险，这加大了对症状前风险分层和监测的需求。研究表明，microRNA(miRNA)作为非编码、约22个核苷酸长度的单链RNA分子，在RNA沉默和基因调控中扮演重要角色，并作为新型生物标志物展现出心衰预后潜力。然而，由于其长度短、浓度低且不同家族成员间序列高度相似，miRNA的检测极具挑战。现有技术如Northern印迹、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、微阵列和RNA测序等方法，普遍存在昂贵、耗时且无法在非临床环境中使用的局限。因此，开发一种能在非临床环境（如家庭或床旁）下进行、简单可靠、高灵敏度与特异性的miRNA检测方法，对于心衰的早期诊断和健康管理至关重要。
技术原理：基于PCR的比色miRNA传感技术(CQmiR)
本研究开发的CQmiR技术，其流程主要分为三个部分：miRNA分离、可视化启动和LAMP扩增。核心技术在于使用p19(一种病毒双链RNA结合蛋白)功能化的硅纳米探针贴片，从全血样本中高效分离特异性miRNA。检测时，向血样中加入特异性捕获探针，与目标miRNA杂交形成双链RNA(dsRNA)。随后，这些dsRNA双链体被纳米探针表面固定的p19蛋白选择性捕获，而未结合的分子和单链RNA则被洗去。LAMP模板序列设计用于与捕获探针的10个核苷酸突出端杂交，进而启动LAMP反应。如果目标miRNA存在，反应会产生质子，导致pH从中性变为酸性。这一变化可通过pH颜色指示剂（酚红）可视化，颜色从粉红色变为黄色（pH 6.8时）。通过监测反应速度（即颜色变化所需时间），可对目标miRNA进行定量分析。
得益于纳米探针贴片显著增大的表面积和垂直结构，其miRNA捕获能力比平面贴片高出约6倍。该生物芯片在4°C下储存5天后仍保持功能，并可实现多达20个再生循环，同时保持良好的捕获效率和稳定性。
定量传感与性能分析
1. 定量传感可行性验证
研究首先使用预先设计的寡核苷酸模板和商业比色LAMP试剂盒验证了比色定量传感的可行性。通过智能手机记录反应过程视频，在CIELAB颜色空间中分析颜色变化。结果显示，随着LAMP模板浓度从100 pM降至1 fM，反应的激活时间（颜色从粉红变为黄色的时间点）从约19分钟增加至35分钟。该方法的检测限(LOD)低至1.26 × 10-16M，证明了基于CIELAB模型的比色方法能有效获得定量传感结果。
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2. 检测灵敏度与特异性
接下来，研究验证了CQmiR在磷酸盐缓冲液(PBS)和全血中检测外源性加入的心衰相关miRNA（以let-7a为例）的能力。结果表明，目标miRNA浓度与反应时间之间存在显著的负相关线性关系。在PBS中，miRNA浓度从10 pM降至100 aM时，激活时间从18.2±0.75分钟增加至34.0±0.89分钟，LOD为1.73 × 10-17M。在全血中，LOD为2.26 × 10-17M，动态范围约为5-6个数量级，表明该技术在全血环境中同样有效。
特异性测试显示，只有当目标miRNA与其完全互补的诱饵序列结合时，才会产生阳性反应（B ? kA > 0），而错配的诱饵序列则保持阴性。重要的是，对于序列仅有一个核苷酸差异的let-7a、let-7b和let-7c家族成员，CQmiR也能有效区分，实现了单核苷酸特异性，假阳性率仅为0.44%。
2=0.975。(c) 小提琴图显示全血中目标miRNA浓度与LAMP反应激活时间的关系，R2=0.973。">
在啮齿动物模型中预测心力衰竭
为了验证CQmiR检测心衰miRNA的可行性，研究建立了异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心衰模型。通过Masson三色和H.E.染色，以及基于硅贴片的荧光免疫法检测B型利钠肽(BNP)水平，确认了模型可靠性。14天ISO注射组小鼠的BNP水平显著升高，心肌细胞排列紊乱、细胞核溶解、炎性细胞浸润，并伴有胶原纤维沉积明显增加，表明其处于心衰状态；7天ISO注射组则被视为心衰前状态。
研究选取了9种与心衰相关的miRNA（miR-423-5p、let-7i-5p、miR-18a-5p、miR-223-3p、miR-301a-3p、miR-652-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p和miR-30e-5p）进行检测。结果显示，miR-652-3p和miR-30e-5p等miRNA的表达水平在不同组别间存在显著差异，能够有效区分心衰组与非心衰组。
为了进行稳健的风险分层，研究对CQmiR测量的miRNA数据应用了t-SNE可视化和决策树分类器。t-SNE图显示，三个实验组的小鼠形成了三个不同的簇，其中7天ISO注射组位于14天ISO注射组和正常组之间，表明该miRNA特征谱可以在BNP水平升高及组织病理学变化之前，更早地检测到7天ISO诱导的心衰前状态。决策树模型经过训练，对小鼠心衰风险的总体分类准确率达到88.89%。模型的特征重要性分析显示，miR-652-3p的评分贡献了39.93%，miR-30e-5p的评分贡献了其余部分，这两者被确定为最重要的预测特征。通过对未知样本的测试，模型可以依据其miR-652-3p和miR-30e-5p的评分，准确地预测其属于心衰风险组还是正常组。
讨论与结论
心力衰竭是一种逐渐恶化的疾病，及时的监测有助于早期发现病理状况并进行及时干预。本研究开发的CQmiR技术，利用在RNA结合蛋白(p19)功能化纳米探针阵列上进行的比色LAMP反应，能够在非临床环境下（例如家庭环境）约2小时内完成，并利用低成本试剂实现快速miRNA检测。该技术通过监测反应单元颜色变化的时间来测量全血中目标miRNA的浓度。在小鼠心衰模型中，研究使用一组九种miRNA验证了CQmiR平台。基于CQmiR量化miRNA水平训练的决策树分类器，能够准确地对小鼠进行心衰风险分层，准确率达88.9%，并确定了miR-652-3p和miR-30e-5p为两个最重要的预测特征。
与当前临床金标准（如血浆或血清NT-proBNP和BNP）相比，CQmiR平台能够直接使用未处理的全血，并能在症状出现前（如ISO注射7天后）检测到分子水平的失调，显示出早期预警潜力。本研究中识别的特定miRNA，如miR-652-3p和miR-30e-5p，已被独立证实与早期心肌细胞应激、炎症和纤维化相关，且先于利钠肽的显著升高。与单一miRNA生物标志物相比，多重特征谱方法进一步提高了特异性。
尽管概念验证是在啮齿动物模型中完成的，但该技术展现出作为一种互补性、超低成本、真正无需设备的筛查工具的潜力，适用于缺乏实验室基础设施和血浆分离条件的早期非临床或资源有限环境。将其转化为临床应用，后续需要在大型人类队列中进行前瞻性临床验证。人工智能(AI)与生物传感和移动诊断的整合，有望进一步提升CQmiR的诊断能力，通过分析个体健康数据实现个性化诊疗，改善医疗结果。
