《Journal of Chemical Theory and Computation》：Characterizing the Conformational Dynamics of the Ribose Transporter B Protein in Escherichia coli: Enhanced Sampling via Multiple Force Fields
编辑推荐：
本研究采用分子动力学（MD）模拟，结合CHARMM36(m)、AMBER ff19SB及SIRAH混合三种力场，首次完整观测到了大肠杆菌周质核糖转运蛋白B（RbsB）从闭合到开放的构象转变过程。文章深入探究了构象变化与核糖（ribose）解离的时序关系，揭示了Asp69–Arg139盐桥在稳定闭合构象中的关键作用，并识别出一个可能介导核糖-蛋白相互作用的稳定水分子。通过比较不同力场下蛋白的采样行为，研究论证了利用多种力场组合来增强构象采样的策略，为理解周质结合蛋白（PBP）的配体释放机制提供了新的分子层面见解。
本研究聚焦于大肠杆菌（Escherichia coli）中负责核糖高亲和力摄取的周质结合蛋白——核糖转运蛋白B（RbsB）。RbsB作为典型的周质结合蛋白（PBP），具有两个由铰链区连接的结构域，其构象在配体（核糖）结合时从开放态转变为闭合态，从而将底物捕获在结构域间的裂隙中，这一过程对于后续通过ABC转运蛋白将核糖转运至细胞质至关重要。
方法
为深入探究RbsB的构象动态，研究采用了分子动力学（MD）模拟策略，并运用了三种不同的力场-水模型组合以增强采样并减少单一力场的潜在偏倚：AMBER ff19SB力场搭配OPC水模型、CHARMM36(m)力场搭配TIP3P水模型，以及CHARMM36(m)力场搭配TIP3P（近蛋白区域）与粗粒化SIRAH WT4水（主体水区域）的混合模型（简称SIRAH hybrid）。研究模拟了六个不同的RbsB起始结构，包括闭合的核糖结合态（holo， PDB 2DRI）、闭合的无配体态（apo， PDB 2DRI）、开放的野生型无配体态（apo， PDB 1URP）、AlphaFold预测的开放结构（AF-P02925），以及两个开放的无配体突变体结构（PDB 1BA2的构象A和B）。对每个系统进行了多个独立重复模拟，每个模拟时长为1微秒（μs），总计模拟时间达到102微秒。模拟在303 K温度下进行，使用GROMACS软件包。分析手段包括计算均方根偏差（RMSD）、回转半径（RoG）、结构域张开角度、溶剂可及表面积（SASA）以及主成分分析（PCA）等。
结果与讨论
1. 结合态与非结合态RbsB的模拟分析
从闭合构象（2DRI， 有/无核糖）开始的模拟结果显示，蛋白质的二级结构在所有模拟中均保持稳定。在核糖结合（holo）的模拟中，核糖在结合位点的停留时间表现出力场依赖性：AMBER和CHARMM力场下仅各有1个重复模拟发生了核糖解离，而在SIRAH hybrid力场下，7个重复模拟中有4个发生了核糖解离。进一步分析发现，在绝大多数情况下（除SIRAH hybrid的1个重复模拟外），蛋白质的构象变化（从闭合态向开放态转变）发生在核糖从结合位点解离之前。这一过程与一个关键的盐桥（Asp69–Arg139）的稳定性密切相关，该盐桥的断裂通常预示着蛋白质的张开和核糖的释放。
构象转变通过计算两个主要结构域之间的张开角度进行量化。模拟中观察到的角度值与实验测得的开放（~94°， 源自PDB 1URP）和闭合（~66.4°， 源自PDB 2DRI）构象角度相符。当核糖解离时，张开角度通常增大至与开放构象一致的值。同时，研究在结合位点识别出一个结构水分子，该水分子在晶体结构（2DRI）中也被观测到，它可能与核糖以及结合位点残基（如Arg89和Asp141）形成氢键，可能对稳定结合的核糖起到作用。
2. 力场依赖性行为研究
对多种无配体（apo）起始结构的模拟分析揭示了不同力场下RbsB结构动态的差异。所有力场下的模拟均未出现系统性结构漂移，RMSD均达到稳定平台。在回转半径（RoG）的分布上，AMBER力场的模拟倾向于产生更离散且平均值略高的分布，其峰值更接近突变体B结构（~2.05 nm）的RoG值；而CHARMM和SIRAH hybrid力场的模拟则显示出更宽、左偏（即更紧凑）的分布。
张开角度分析进一步确认了力场间的差异。对于无配体系统，AMBER力场模拟的张开角稳定在约100°左右，与突变体B构象（~100°）更为接近；而CHARMM和SIRAH hybrid力场模拟的角度则围绕在约94°附近波动，更接近野生型开放构象（1URP， ~94°）。此外，CHARMM和SIRAH hybrid模拟表现出比AMBER模拟更大的角度波动。
对于核糖结合的2DRI系统，模拟识别出三种不同的构象状态：与配体结合闭合态一致的闭合状态（~66.4°）、围绕~80°波动的中间状态，以及持续超过~90°的开放状态。SIRAH hybrid力场促使更多重复模拟（4/7）达到了完全开放状态。主成分分析（PCA）将AMBER和SIRAH hybrid力场下核糖结合2DRI的模拟轨迹区分为两个主要簇，分别对应闭合的holo态和开放的apo态。而CHARMM力场的模拟则主要聚集在一个代表中间状态的单一簇中。
3. 收敛性分析
研究通过多种方法评估了模拟采样的收敛性。基于聚类的分析表明，主要的构象簇包含来自多个独立重复模拟的帧，而非单一轨迹，说明不同模拟收敛到了相同的优势构象盆地。累计平均RMSD及其标准偏差分析显示，RMSD迅速达到平台期并保持稳定，表明结构波动在模拟时间尺度内达到了统计平稳性。此外，基于Grossfield和Zuckerman协议的块分析表明，随着块大小的增加，估计的标准误差趋于收敛，支持了对相关构象状态已进行充分采样的结论。
结论
本研究首次完整观测到了周质结合蛋白RbsB从闭合到开放的构象转变。结果表明，在大多数情况下，蛋白质的构象变化先于核糖从结合位点的解离。特定的盐桥相互作用，尤其是Asp69–Arg139盐桥，对于稳定蛋白质的闭合构象至关重要。研究还确认了一个在晶体结构中同样存在的结构水分子，它可能在稳定结合位点的核糖方面发挥作用。通过对三个不同力场的比较，研究发现SIRAH hybrid力场促进了更频繁的从闭合态到开放态的构象转变，这可能与其采用的混合水模型有关。AMBER力场倾向于采样更接近突变体B的开放构象，而CHARMM和SIRAH hybrid力场则更接近野生型开放构象。研究证实了之前关于突变体A（1BA2_A）和B（1BA2_B）超延伸构象可能是溶液中较少出现状态的推测，其中突变体A的构象（~113°）仅在单个模拟中短暂达到。总体而言，这项工作阐明了RbsB配体释放的机制涉及由构象异质性和瞬态稳定相互作用调控的协同结构域重排，并证明了结合多种力场和起始构象的策略能够更全面地刻画蛋白质的构象图谱。
