《Journal of Proteome Research》：Targeted Quantitative Analysis of Specific Proteins in Cytosolic, Mitochondrial, and Nuclear Fractions Using PRM
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作为本文的责任编辑，我向读者推荐这篇具有方法学创新意义的研究。该文针对肝脏研究中的关键难题——亚细胞组分（尤其是线粒体）分离纯度的评估，开发并验证了一种基于平行反应监测（PRM）的靶向蛋白质组学定量策略。该方法避免了传统免疫印迹法的诸多局限，为获得高质量线粒体制剂以支撑下游功能与蛋白质组学分析（例如在代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）等研究中），提供了灵敏、可重复且经济高效的解决方案。
引言：肝脏线粒体研究中的纯度评估挑战
线粒体作为细胞的能量工厂，在肝脏生理学中扮演核心角色，调控关键代谢过程。因此，线粒体功能障碍是多种肝脏疾病的标志，包括脂肪变性、脂肪性肝炎和肝切除术后肝衰竭。亚细胞分馏被广泛用于从肝细胞或组织中分离线粒体；然而，分离组分的富集度和纯度对于确保下游功能与蛋白质组学分析的可靠性至关重要。传统的验证方法，如细胞器特异性标记物的免疫印迹，受到通量低、灵敏度有限和变异性大的限制。本研究提出了一种基于平行反应监测（PRM）的靶向蛋白质组学策略，用于定量评估使用商业分离试剂盒从肝脏样本中获得的胞质、线粒体和核组分的富集情况。
方法：PRM策略的设计与实施
研究使用了FVB野生型小鼠的肝脏组织和PLC/PRF/5细胞系。分别使用针对组织和培养细胞的线粒体分离试剂盒（Pierce）分离线粒体和胞质组分，并使用核纯化制备试剂盒（Sigma）分离核组分。
为确保评估的准确性，研究精心挑选了六个细胞器特异性蛋白质作为标记物：核组分选用前 lamin A/C和核仁磷酸蛋白（NPM）；胞质组分选用热休克蛋白90β（HSP90AB1）、S-腺苷高半胱氨酸水解酶（AHCY）和甲硫氨酸腺苷转移酶IIα（METK2）；线粒体组分选用氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1）、ATP合酶亚基α（ATP5F1）和NADH脱氢酶复合体组装因子4（NDUFAF4）。这些标记物的选择基于UniProt、Human Protein Atlas等数据库的现有证据。
蛋白样品经胰蛋白酶消化后，通过纳升液相色谱1.耦联高分辨率质谱（nLC-ESI-MS/MS）在PRM模式下进行分析。数据使用Skyline软件进行处理和定量，并通过GraphPad Prism进行统计学分析。
结果与讨论
1. PRM方法在PLC/PRF/5细胞亚细胞组分中的评估
PRM分析在PLC/PRF/5细胞中证明了稳健且区室特异性的富集。
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核组分富集：前 lamin A/C和核仁磷酸蛋白（NPM）在核组分中的丰度显著高于胞质和线粒体组分。
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线粒体组分富集：ATP合酶亚基α（ATP5F1）和NDUFAF4在线粒体组分中的水平显著高于胞质和核组分。CPS1在线粒体组分中的丰度也高于其他组分，但与胞质组分的差异未达到统计学显著性。
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胞质组分富集：SAHH（AHCY）、HS90B（HSP90AB1）和METK2在胞质组分中的丰度均显著高于线粒体和核组分。
富集比（ER）分析进一步显示，核标记物在核组分中相对于线粒体组分富集超过10倍。这些结果共同证实了所用亚细胞分馏方案的有效性和特异性，各组分交叉污染极少。
2. PRM方法在肝组织亚细胞分馏与蛋白富集评估中的应用
在肝组织样本中评估了相同的标记蛋白组，总体趋势与细胞模型一致，但也存在一些差异。
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核组分富集：前 lamin A/C和核仁磷酸蛋白（NPM）在核组分中丰度较高，但与胞质或线粒体组分的差异未达到统计学显著性，这可能与核组分在复杂组织中更容易发生交叉污染有关。
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线粒体组分富集：Cps1和Atpase在线粒体组分中的丰度显著高于核和胞质组分，表明线粒体组分成功富集。然而，Ndufaf4在各组分间未显示出显著差异，这主要归因于生物重复间的高变异性，可能与所用商业分离试剂盒固有的交叉污染有关。
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胞质组分富集：Sahh（AHCY）、Hs90b（HSP90AB1）和Metk2在胞质组分中的丰度均显著高于线粒体和核组分，支持将这些蛋白作为评估胞质区室富集度的检查点。
这些发现证实了PRM策略在更复杂的组织样本中的适用性。
3. 研究的优势、局限与展望
本研究建立的PRM方法为评估亚细胞组分（尤其是线粒体）的富集纯度提供了一种灵敏、可重复、高通量且不依赖于抗体的有力工具。相比传统免疫印迹，PRM具有更高的特异性、灵敏度和定量准确性。
然而，研究也存在一些局限。首先，该工作流目前仅在鼠肝和PLC/PRF/5肝癌细胞中得到验证，其在不同代谢功能组织（如心脏、骨骼肌）中的普适性需要进一步验证，因为线粒体蛋白质谱具有组织特异性。其次，PRM的实施需要高分辨率准确质量（HRAM）质谱仪和靶向蛋白质组学数据分析的专业知识，这在某种程度上限制了其在常规生物学实验室的即时可及性。因此，PRM应被视为对传统免疫印迹的补充而非完全替代。最后，公共数据库中关于蛋白质亚细胞定位的注释有时存在不一致，这在进行结果解读时需要考虑。
总体而言，这项PRM驱动的策略不仅可靠地评估了分馏方案的表现，也为判断样本是否适用于下游精确的区室特异性蛋白质组学分析提供了关键质控手段。该方法有望在翻译肝脏病学研究中，为获得高质量的线粒体制剂并进而深入研究肝病（如代谢相关脂肪性肝病（MAFLD））的分子发病机制提供坚实的技术支撑。
