SimHS-AFMfit-MD：一种集成方法揭示Alpha-辅肌动蛋白原子构象动力学

《Nano Letters》：SimHS-AFMfit-MD: An Integrative Approach for Inferring Alpha-Actinin Atomic Conformational Dynamics

本文推荐了一篇创新的综述，介绍了一种名为SimHS-AFMfit-MD的集成框架。该方法巧妙结合高速原子力显微镜（HS-AFM）、分子动力学（MD）模拟和基于AFMfit的结构建模，将数千张HS-AFM三维表面图像转化为原子尺度的构象集合，从而以原子分辨率推断柔性蛋白质（如alpha-辅肌动蛋白）的动态构象，填补了传统成像与模拟方法在时空尺度上的鸿沟。

　　

概述：结合HS-AFM、AFMfit与MD模拟的方法学

研究旨在开发一个集成工作流程，以研究蛋白质的原子构象和动力学。理解原子结构固然重要，但探索蛋白质动力学（如折叠和相互作用过程）同样关键，因为这些直接影响其生物学功能。高速原子力显微镜（HS-AFM）能够在溶液环境中提供蛋白质功能过程中其动力学和表面结构变化的洞察。尽管HS-AFM具有高时间分辨率，但它缺乏其他实验技术（如X射线晶体学或冷冻电子显微镜（cryo-EM））的原子空间分辨率。因此，原子力显微镜（AFM）面临的主要挑战之一在于如何将其低分辨率的三维表面图像解释为详细的三维原子构象。

我们方法的核心在于结合了多种技术：HS-AFM、AFMfit（一种拟合AFM图像的方法）、非线性正常模式分析（NMA）和分子动力学（MD）模拟，从而建立起SimHS-AFMfit-MD流程（如图1所示）。该工作流程包括四个关键步骤：（i）获取实验AFM图像和蛋白质模型（PDB文件）；（ii, iii）AFM拟合（即AFMfit-NMA, AFMfit-MD）和MD模拟，以生成原子构象库（PDB）；（iv）主成分分析（PCA），根据其主成分（PCs）对动态原子构象进行分类。通过整合这些技术，我们可以更全面地了解蛋白质的三维原子结构，以及它们在功能活动过程中的动力学和构象变化。

我们应用此方法分析了Ca²⁺结合与非结合状态的alpha-辅肌动蛋白在毫秒到秒时间尺度上的构象变化，并确定了该蛋白质的原子构象动力学。Alpha-辅肌动蛋白是一种反向平行同源二聚体，分子量超过200 kDa。鸡胗平滑肌alpha-辅肌动蛋白的结构包括以下结构域：N端肌动蛋白结合域（ABD），其中两个钙调蛋白同源结构域1和2（CH1, CH2）广泛接触；包含四个血影蛋白样重复序列（SR1-SR4）或杆状域的中心区域；以及C端钙调蛋白样结构域（CaMD），其中包含两对EF手基序（EF12和EF34），EF12结构域负责Ca²⁺结合。两个ABD经历90度旋转，使alpha-辅肌动蛋白能够以几乎任何方向交联肌动蛋白丝。

Ca²⁺结合影响平滑肌Alpha-辅肌动蛋白的柔韧性

首先，我们使用HS-AFM获取了alpha-辅肌动蛋白的高时空分辨率图像。在近生理条件下，以每帧100毫秒的成像速率连续记录了单个Ca²⁺结合与非结合的alpha-辅肌动蛋白分子的三维分子表面图像，这些分子通过非特异性静电相互作用弱吸附在云母上（图2）。从静电角度来看，alpha-辅肌动蛋白在生理pH下携带大量净负电荷（-54e），这削弱了与带负电的云母表面的非特异性静电吸附。成像缓冲液部分屏蔽了表面静电相互作用，允许足够的吸附以实现稳定成像，同时保留了构象自由度。因此，观察到的运动处于物理合理的范围内，内部灵活性得以保持。

我们成功捕获了alpha-辅肌动蛋白分子在云母上的真实同源二聚体特征，其外观与交联肌动蛋白丝的Ca²⁺结合和非结合alpha-辅肌动蛋白的同源二聚体结构一致。这些结果表明，观察到的构象反映了与其生物功能相关的内在结构特征。数千个alpha-辅肌动蛋白分子的构象动力学，包括弯曲和扭转运动，在我们的AFM图像中被成功捕获和可视化。为了区分这两种状态之间的构象动力学，我们半自动地追踪了多个alpha-辅肌动蛋白分子在连续帧中两个相对ABD球体的位置，并计算了它们峰高之间的距离。HS-AFM分析表明，虽然alpha-辅肌动蛋白的整体长度在有无Ca²⁺存在时相似，但两种状态的整体高度存在显著差异。从HS-AFM数据集来看，Ca²⁺结合alpha-辅肌动蛋白的平均高度和长度分别为5.7±0.9 nm和25.1±2.3 nm，而Ca²⁺非结合状态分别为4.8±0.7 nm和25.0±3.2 nm。结果显示高度分布存在统计学显著差异，但长度在两种状态间无显著差异。

通过SimHS-AFMfit-MD在原子水平研究Alpha-辅肌动蛋白动力学

我们基于HS-AFM的分析有助于阐明alpha-辅肌动蛋白的一些特性，包括其高度和长度随时间的波动。然而，这些传统的AFM处理技术无法揭示alpha-辅肌动蛋白原子构象动力学的关键见解，因为它们只提供了其表面结构。但理解这些运动对于把握alpha-辅肌动蛋白的肌动蛋白交联功能对肌动蛋白丝结构、动力学和功能的机械影响至关重要。

因此，我们通过整合HS-AFM与AFMfit-NMA或AFMfit-MD以及MD模拟，开发了SimHS-AFMfit-MD流程。该流程包括四个步骤，使我们能够进一步研究alpha-辅肌动蛋白的动力学和原子结构。我们利用AFMfit-NMA和AFMfit-MD将从HS-AFM获得的alpha-辅肌动蛋白三维分子表面转化为三维原子构象。通过这种方法，我们为Ca²⁺结合和非结合alpha-辅肌动蛋白状态创建了原子构象库。然后将这些构象对齐，以基于AFMfit-NMA、AFMfit-MD和MD模拟比较两种状态的动力学。与MD模拟相比，AFMfit-NMA分析中Cα位置的分布更广，但AFMfit-MD与MD模拟之间的分布非常相似。值得注意的是，将MD轨迹信息整合到AFMfit（AFMfit-MD）中产生的构象库与MD模拟生成的构象库更为一致。基于NMA的结构拟合捕获了Ca²⁺结合和非结合状态之间的构象变化，这些变化与2微秒无偏MD模拟和AFMfit-MD中观察到的结果相当。

使用均方根涨落（RMSF）来量化每个Cα原子相对于其平均位置的偏差，该指标使用了通过AFMfit-NMA、AFMfit-MD和MD模拟生成的构象库。结果揭示了ABD内的CH1-CH2、颈部以及EF12-EF34结构域的动态运动。然而，杆状结构域（SR1–SR4）表现出相对较高的刚性。

我们还分析了结构域间距离以及alpha-辅肌动蛋白ABD的弯曲和扭转角度，以表征alpha-辅肌动蛋白在Ca²⁺结合和非结合状态下的动态构象。这些分析现在可以通过我们的SimHS-AFMfit-MD框架实现。总体而言，SimHS-AFM-MD分析表明，Ca²⁺结合略微降低了肌肉alpha-辅肌动蛋白中颈部附近CH1-CH2和EF12-EF34结构域的运动。

通过PCA对Alpha-辅肌动蛋白的动态原子构象进行分类

主成分分析（PCA）是一种用于降低数据集维度同时保留其最显著变化的统计方法。它在利用主成分（PCs）识别和分类单个蛋白质结构域的集体运动方面非常有效。

首先，我们通过分析从AFMfit-NMA、AFMfit-MD、NMA和MD模拟获得的构象库，确定了Ca²⁺结合和非结合alpha-辅肌动蛋白的原子运动集合，并将这些运动投影到一个共同的PCA空间。使用主成分1（PC1）、PC2和PC3的特征值来确定每种运动对总运动的贡献百分比。PC1（28.7%）主要捕获了x轴上的弯曲运动集合，PC2（19.1%）代表了y轴上的弯曲运动，PC3（9.8%）描述了扭转运动。

为了将AFMfit-NMA、AFMfit-MD、NMA和MD模拟获得的数据与通过冷冻电镜（cryo-EM）和X射线衍射获得的静态构象（PDB: 1SJJ和4D1E）进行比较，我们将从AFMfit-NMA、AFMfit-MD、NMA和MD模拟生成的Ca²⁺结合和非结合alpha-辅肌动蛋白的构象库投影到一个共同的PCA空间，并绘制了PC1与PC2以及PC1与PC3的分布图。对于Ca²⁺结合和非结合状态，来自AFMfit-NMA构象库的PC1和PC2沿x-y轴的集体弯曲运动分布与来自AFMfit-MD和MD模拟库的分布相当。单独的NMA集合分布，正如预期的那样，遵循谐波定律，并且比MD集合和AFMfit构象的分布受限得多。它仍然在某种程度上类似于非结合MD模拟的分布，但与结合状态相比有所偏移。因此，AFMfit-NMA和AFMfit-MD构象之间的差异对于Ca²⁺结合状态更为明显。

我们观察到PC3的趋势不同，它捕获了方法之间Ca²⁺结合和非结合状态的扭转运动集合。然而，与主要描述集体弯曲运动的PC1和PC2相比，PC3仅占总构象变异性的很小一部分。来自冷冻电镜和X射线衍射的构象是静态的，占据构象空间的不同区域，突出了HS-AFM、X射线和冷冻电镜技术之间的方法学差异，而非直接的不一致。我们注意到，通过冷冻电镜和X射线衍射解析的非结合肌肉alpha-辅肌动蛋白的静态构象（PDB: 1SJJ和4D1E）也有所不同。尽管据报道肌肉alpha-辅肌动蛋白对Ca²⁺结合不敏感，但我们的HS-AFM和SimHS-AFMfit-MD分析揭示了以前无法获得的Ca²⁺结合和非结合状态的动态原子构象。Ca²⁺结合略微降低了肌肉alpha-辅肌动蛋白中颈部附近CH1-CH2和EF12-EF34结构域的运动。

总体而言，AFMfit-NMA捕获了alpha-辅肌动蛋白的主要弯曲运动（PC1和PC2），与AFMfit-MD和MD模拟在Ca²⁺结合和非结合状态下都高度一致。在PC3中观察到的差异反映了仅占总构象方差很小一部分的次要扭转运动。从独立MD模拟得到的涨落曲线和主要动态模式与从SimHS-AFMfit-MD推断的构象动力学一致，但在统计上是独立的。因此，这种一致性为我们的方法提供了正交验证，表明AFM衍生的拟合捕获了物理上有意义的运动，而不仅仅是复现指导性的MD信息。

在所有结果中，SR1和SR4中由蓝色箭头表示的特征向量分量或运动幅度较小。然而，SR2和SR3中的分量几乎没有运动。这些结果证实了杆状结构域的刚性，与先前的研究一致。相比之下，在ABD内的CH1–CH2、EF12–EF34和颈部结构域中观察到了显著的特征向量分量，表明这些区域具有相对较高的柔韧性。总之，我们的SimHS-AFMfit-MD方法展示了捕获和分类Ca²⁺结合和非结合alpha-辅肌动蛋白原子构象动力学的能力。

通过整合HS-AFM与AFMfit-NMA、AFMfit-MD以及通过SimHS-AFMfit-MD进行的MD模拟，我们生成了全面的原子构象库，并针对MD轨迹进行了验证。这种方法使得能够通过PCA研究alpha-辅肌动蛋白的物理运动和原子结构，同时也提供了一种强大的方法来增强低分辨率AFM数据的解释。例如，alpha-辅肌动蛋白的扭转和弯曲运动通过由MD轨迹引导的AFMfit和无偏全原子MD模拟进行了交叉验证。这种能力可能有助于更好地理解先前使用X射线衍射和冷冻电镜进行的静态结构研究。来自SimHS-AFMfit-MD的数据有助于开发用于模拟复杂蛋白质模型的力场。更广泛地说，构象库还可以作为深度学习模型的训练数据，帮助预测跨时间尺度的蛋白质动力学，并弥合实验与计算方法之间的差距。